Identifiering av växtisbindande proteiner genom bedömning av iskristallisationshämning och isolering med användning av isaffinitetsrening
Summary
I detta dokument beskrivs identifiering av is-bindande proteiner från fryst toleranta växter genom den bedömning av is-omkristallisation-inhibitionsaktivitet och efterföljande isolering av nativa IBPS användning is-affinitetsrening.
Abstract
Is-bindande proteiner (IBPS) tillhör en familj av stressinducerade proteiner som syntetiseras av vissa organismer som utsätts för temperaturer under noll. I växter, sker frysskada när extracellulära iskristallerna växer, vilket resulterar i bristning av plasmamembran och eventuell celldöd. Adsorption av IBPS till iskristaller begränsar ytterligare tillväxt genom en process känd som is-omkristallisation inhibering (IRI), och därigenom minska cellulär skada. IBPS demonstrerar också förmågan att sänka fryspunkten för en lösning under jämviktssmältpunkt, en egenskap som kallas termisk hysteres (TH) -aktivitet. Dessa skyddande egenskaper har höjt intresset för identifiering av nya IBPS på grund av deras potentiella användning i industriella, medicinska och jordbruksapplikationer. Detta dokument beskriver identifieringen av växt IBPS genom en) induktionen och extraktion av IBPS i växtvävnad, 2) screening av extrakt för IRI-aktivitet, och 3) isolering och purifblue av IBPS. Efter induktionen av IBPS genom exponering vid låg temperatur, är extrakten testas för IRI aktivitet med användning av en 'splat assay', som medger observation av iskristalltillväxt användning av en standardljusmikroskop. Denna analys kräver en proteinkoncentration låg och genererar resultat som snabbt erhålles och enkelt tolkas, vilket ger en initial skärm för is bindningsaktivitet. IBPS kan sedan isoleras från kontaminerande proteiner genom att använda egenskapen hos IBPS att adsorbera till is, genom en teknik som kallas 'ice-affinitetsrening'. Använda cellysat som samlats in från växtextrakt, kan en is hemisfär långsamt odlas på en mässingssond. Detta inkorporerar IBPS i den kristallina strukturen hos den polykristallina is. Kräver ingen a priori biokemisk eller strukturell kunskap om IBP medger denna metod för utvinning av aktivt protein. Is-renade proteinfraktioner kan användas för tillämpningar efter innefattande fastställande av peptide sekvenser genom masspektrometri och den biokemiska analysen av nativa proteiner.
Introduction
Is-bindande proteiner (IBPS) är en mångfaldig familj av skyddande proteiner som har upptäckts i ett antal organismer, inklusive växter 1, insekter 2, fisk 3, och mikrober 4. Det viktigaste inslaget i dessa proteiner är deras unika förmåga att specifikt och effektivt adsorberas till iskristaller, ändra deras tillväxt. IBPS har flera dokumenterade egenskaper, med de två mest väl karaktäriserade är termisk hysteres (TH) och is-återkristallise inhibering (IRI). TH-aktivitet är mera lätt observeras i IBPS framställda i fryst intoleranta djur. Denna aktivitet resulterar i sänkning av fryspunkten för organismernas cirkulations eller interstitiell vätska för att förhindra frysning. Däremot i frysttoleranta organismer, vilket oundvikligen kommer att frysa vid temperaturer under noll, IBPS verkar ha låg TH-aktiviteten. Trots den låga TH-aktiviteten, till en hög IRI aktivitet begränsa iskrstal tillväxt observeras ofta med dessa proteiner. För frys tolerant organism, bidrar detta IRI aktivitet förmodligen skyddar cellerna från okontrollerad tillväxt av is i extracellulära fack.
Den "madrass knappen" modellen kan användas för att beskriva mekanismen genom vilken IBPS förhindra tillväxt av iskristaller 5. Enligt denna modell, IBPS specifikt adsorbera till iskristallen ytan med intervaller, så att vattenmolekyler endast kan införliva med den växande is kristallgittret i utrymmet mellan bunden IBPS. Detta skapar en krökning som gör inkorporering av ytterligare vattenmolekyler ogynnsamma, en händelse som kan beskrivas med Gibbs-Thomson-effekten 6. Den förankrade klatrat vatten hypotes ger en mekanism för den specifika bindningen av IBPS till iskristallen ytan, varigenom närvaron av laddade rester, specifikt placerad på protein is-bindningsstället, resulterar i den reorganisation av vattenmolekyler så att de matchar ett eller flera plan av isen kristallgittret 7.
TH-aktivitet kan kvantifieras genom att mäta skillnaden mellan smält- och frystemperaturer av en enda iskristall i närvaro av en IBP. Medan TH-aktivitet är en allmänt accepterad metod för att utvärdera aktiviteten av IBPS, den låga TH gapet som produceras av växten IBPS (typiskt endast en bråkdel av en grad) som normalt kräver en hög proteinkoncentration, specialiserad utrustning och operatör erfarenhet. Även om icke-IBPS kan begränsa iskristalltillväxt, är det en egenskap som delas av alla IBPS och sålunda testning för IRI aktiviteten en effektiv inledande screening för närvaron av IBPS, särskilt för dem med låg TH-aktiviteten. Den metod som används för att testa denna aktivitet är känd som en 'splat assay', varvid ett proteinprov är snabbfrystes för att producera ett monoskikt av små iskristaller, som observeras under en tidsperiod för att bestämma omiskristalltillväxt är begränsad. Till skillnad från andra metoder som används för att screena ett provkällan vävnad för närvaron av IBPS är denna teknik tillämpbar på låga proteinkoncentrationer i området 10-100 ng, utnyttjar lätt-fabricerade utrustning, och genererar data som snabbt och enkelt tolkas. Emellertid är det viktigt att betona att denna analys ger en initial skärm för IBPS som bör följas genom bestämning av TH och iskristall formning.
Isoleringen av nativa proteiner är utmanande, som ofta kräver information om de strukturella och biokemiska egenskaperna hos ett protein av intresse. Affiniteten av IBPS för ice möjliggör för isolering av dessa proteiner med användning is som ett substrat för reningsändamål. Eftersom majoriteten av molekylerna skjuts framåt av isvatten gräns under iskristalltillväxt, långsam tillväxt av en is-hemisfär i närvaro av en IBP provresulterar i ett högt renat prov, som saknar stora quantittalet av kontaminerande proteiner och lösta ämnen. Denna metod har använts för att identifiera IBPS från insekter 8, 9, 10, bakterier 11, fisk 12 och växter 13, 14. Dessutom kan de IBP-anrikade fraktionerna som uppnås genom denna metod även användas för nedströms biokemisk analys. I detta dokument beskrivs identifiering av IBPS i växter genom induktion och extraktion av IBPS, till analys av IRI-aktivitet bekräftar närvaron av proteiner och isolering av proteiner med användning av is affinitetsrening.
Protocol
Representative Results
Discussion
För framgångsrik analys och rening av IBPS är det viktigt att förstå temperaturkänsliga karaktären hos vissa av dessa proteiner. Viss växt IBPS blir instabila vid temperaturer över 0 ° C, vilket resulterade i utfällning, utfällning och inaktivitet. I syfte att erhålla aktiva IBPS, är det ofta kritiskt att växter bearbetas i ett kallt rum (~ 4 ° C) och proverna hålls på is under experimenterande. En annan faktor att beakta vid användning av helcells-rålysat är nedbrytningen av proteiner genom endogen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av en NSERC (Canada) bidrag till VKW.
Materials
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/ camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
- Sidebottom, C., et al. Heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256 (2000).
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L. Biochemistry of fish antifreeze proteins. FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. Hyperactive antifreeze protein in a fish. Nature. 429 (6988), 153 (2004).
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. Ice-shell purification of ice-binding proteins. Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
