Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정
Summary
침입하는 대 식세포가 순환하는 전구체로부터 성인 조직으로 지속적으로 모집되는 동안, 상주하는 대 식세포는 발달 중에 그들의 조직을 뿌리고, 전구체로부터의 더 이상의 입력없이 유지된다. 상주 대 식세포의 전구 세포는 최근 확인되었다. 여기, 우리는 상주 macrophage progenitors의 유전 적 운명 매핑 방법을 제시한다.
Abstract
대 식세포는 면역 체계의 본능적 인 팔에서 유래 한 전문적인 식균입니다. 정상 상태에서, 정착 성 대 식세포는 성인 조직에서 발견되며, 감염 및 조직 손상의 전조선 파수꾼으로 작용합니다. 다른 면역 세포가 골수에 위치한 조혈 모 및 전구 세포 (HSPC)로부터 지속적으로 재생되는 동안, 상주 대 식세포로 알려진 대 식세포의 혈통은 골수 HSPC로부터의 입력없이 조직 내에서 자체 유지되는 것으로 나타났다. 이 혈통은 뇌에있는 미 글로리아 (microglia), 간에서의 쿠퍼 (Kupffer) 세포 및 표피에서의 랑게르한스 (Hangerhans) 세포에 의해 예시된다. 장 및 결장 고유 층은 HSPC- 독립적 인 상주 대 식세포가없는 유일한 성인 조직이다. 최근의 연구에 따르면 상주 대 식세포는 태아 조혈 모세포 (HSC)와는 별개로 존재하는 전구 세포로부터의 난황낭 조혈 (extra-embryonic yolk sac hematopoiesis)에 기원한다. 난황낭 중 명확한 조혈, eRYthromyeloid progenitors (EMP)는 적혈구 및 골수 양 세포, 특히 상주 대 식세포를 일으킨다. EMP는 난황낭 내에서만 E8.5와 E10.5 일 사이에 발생하며 순환이 연결되면 일찍 태아 간으로 이동하여 적어도 E16.5까지 팽창하고 분화한다. 이들의 자손에는 적혈구, 대 식세포, 호중구 및 비만 세포가 포함되지만 EMP에서 유도 된 대 식세포 만 조직에서 성충까지 지속됩니다. EMP 출현의 일시적인 성격과 HSC 세대와의 일시적인 중첩은 이러한 선조의 분석을 어렵게 만든다. 우리는 유세포 분석기 로 생체 내에서 EMP 및 EMP 유래 세포를 특성화하기 위해 대 식세포 사이토 카인 수용체 Csf1r 프로모터의 발현에 기초한 타목시펜 유도 성 운명 매핑 프로토콜을 확립했다.
Introduction
개발 중에는 골수 계통의 자손이 성인으로 남아있는 여러 가지 연속적인 조혈 전구 세포가 있습니다. 첫째, 단 독성 "원시"전구 세포는 E7.5-E8.25 사이의 마우스 난황낭 1 , 2 에서 출현하고 단핵구 중간체가없는 배아 대 식세포를 일으킨다. 원시 전구 세포로부터 유래 된 대 식세포가 성숙한 뇌에서 미 글로글 리아 (microglia)로 지속되는지는 적극적인 조사 대상으로 남아 있는지 여부. 둘째로, Erythro-myeloid Precursors (EMPs)는 E8.5에서 난황낭에서 발생하고, 혈류에 들어가서 배아를 식민시킨다. EMPs는 Runx1 의존 내피 – 조혈 전이 3 , 4 에서 난황낭 hemogenic endothelium에서 나온다. EMP는 난황낭 내에서 대 식세포로 분화 할 수 있지만 태아 간세포 (E) 9 5 에서 태아 간을 식민지화하고 differen적혈구, 거핵구, 대 식세포, 단구 과립구 및 비만 세포 6 . EMP로부터 유도 된 대 식세포는 발달 및 성인 조직에서 증식능을 나타낸다. 여부 EMP-파생 된 대 식세포는 거의가 분화 경로 7, 8에 대해 알려진대로 차별화의 단핵구 단계는 여전히 논란이 우회. 마지막으로, 조혈 줄기 세포 (HSC)는 대동맥 – 생식기 – 중뇌 골 소 구역에서 적절한 배아 내에서 E10.5로 출현하여 태아 간으로 이동한다. 장기 재 축적 용량을 가진 HSC는 E11 (42 체절 쌍 스테이지에서) 후에 만 검출됩니다 9 . 그곳에서 E12.5와 확연히 구분되는 조혈이 골수로 이동하기 시작할 때까지 분화되어 출생 후 10 일 동안 혈액 세포 생산의 주요 부위가됩니다.
SP면역 반응 및 표현형 마커의 공통점뿐만 아니라 출현시의 일시적 및 일시적 중첩은 지금까지 배아 조혈 전구 세포의 이러한 파동의 특정 기여를 구별하는 우리의 능력을 방해했다. EMP와 HSC 모두 Runx1 의존적 인 방식으로 생성되고 전사 인자 Myb와 성장 인자 수용체 Csf1r (Colony-Stimulating Factor 1 Receptor, Macrophage Colony Stimulating Factor Receptor라고도 함)을 표현하는 반면, EMP는 HSC 는 생체 외 (in vitro) 와 생체 내 (in vivo) 모두 에서 림프 성 잠재력이 결여되어 있으며, 장기간 재생산 가능성이 없으며 계통 마커 Sca- 11 의 표면 발현이 부족합니다. 유전 적 운명지도 작성 모델은 세포 특이 적 및 시간별 방식으로 배아 선조를 표적으로 할 수 있으므로 대 식세포의 개체 발생을 특성화하는 데 필요합니다. 여기서 우리는 두 혈통을 구별하기 위해 실험실에서 사용 된 운명 매핑 프로토콜을 제시합니다대부분의 성인 조직에서 발견되는 대 식세포 : HSC 유래 침윤성 대 식세포 및 HSC 독립적 인 상주 대 식세포.
티슈 상주 식세포 Csf1r 12 사이토 카인 수용체를 발현 MYB 독립적 전구 세포로 역 추적 세 상보 운명 맵핑 전략을 사용하여 6-E8.5 E10.5에서 배아에 존재하고있다. 태아 조혈 모세포를 표지하지 않고 난황낭 조혈을 연구하기 위해 우리는 '개선 된'Cre recombinase와 2 개의 마우스 에스트로겐 수용체 (Mer-iCre-Mer)의 tamoxifen 유도 성 융합 단백질을 발현하는 형질 전환 균주 Csf1r MeriCreMer를 사용한다. Csf1r 프로모터. 따라서 Cre recombinase는 제한된 시간 동안 Csf1r 발현 세포에서 활성화 될 것이다. lox-STOP-lox 카세트 (Rosa26 LSL-eYFP )의 형광 단백질 하류의 형광 단백질을 포함하는 리포터 스트레인과 함께 사용하면,유도시 존재하는 세포뿐만 아니라 그들의 자손의 유전 적 표지. 난황낭 특이성 "원시"전구 세포 또는 태아 조혈 전구 세포를 표지하지 않고 활성 형태의 타목시펜, 4- 하이드 록시 타목시펜 (OH-TAM), EMP 및 대 식세포 표지의 E8.5에서의 투여. 따라서, 우리는 EMPs와 그들의 자손의 immunophenotype을 배아 발달 동안 특성화하고 노른자낭 유래 대식구가 성인 대 식세포에 기여하는지를 평가했다. 원시 전구 세포 유래 대 식세포가이 접근법을 사용하여 표지되는지 여부와 그들이 성인 대식 세포 풀에 기여할 수 있는지 여부를 특성화하기위한 추가 연구가 필요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
조혈 전구 세포의 다른 파동은 짧은 시간 내에 부분적으로 겹쳐서 발달 조혈의 각 파가 면역 세포에 기여하는 것을 기술적으로 매우 도전적으로 분석합니다.
Tamoxifen-inducible Cre 시스템은 ex vivo 또는 in vitro 배양이나 이식을하지 않아도 일시적으로 유도 가능한 방식으로 특정 세포에 태그를 지정하고 배아 또는 성인에서 계통 분석을 수행 할 수있는 기회를 제공?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Frederic Geissmann 교수와 Christian Schulz 교수에게 통찰력있는 토론에 감사드립니다. Hannah Garner 박사는 Xavier Montagutelli 박사와 Jean Jaubert 박사와 파스퇴르 인스 트루먼 트의 동물 병원 직원을 대상으로 비료를 읽었습니다. Amgen Scholar의 Pascal Dardenne과 Vytaute Boreikaite는 기술 지원을 담당했습니다. EGP 연구소의 연구는 파스 티르 인스티튜트 (Institut Pasteur), CNRS, Cercle FSER (FRM, Institut Pasteur 및 REVIVE 컨소시엄의 시작 패키지)에서 지원됩니다 .LI는 REVIVE 컨소시엄의 PhD 펠로우쉽에 의해 지원됩니다.
Materials
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2×5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
References
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