일차 섬모 신경 전구 세포의 증식, 신경 세포 분화, 성인 신경 기능에 근본적으로 중요하다. 여기서 우리는 ciliogenesis 및 기본 neurosphere 문화를 사용하여 신경 줄기 / 전구 세포 및 분화 된 신경 세포의 섬모에 신호 단백질의 인신 매매를 연구하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
일차 섬모는 신경 줄기/전구 세포의 증식과 배아, 출생 후 및 성체 기간 동안의 신경 세포 분화에 근본적으로 중요합니다. 또한, 대부분의 분화된 뉴런은 G-단백질 결합 수용체(G-protein-coupled receptor)와 같은 신호 수용체(signaling receptor)와 아데닐릴 시클라제(adenylyl cyclase)와 같은 신호 분자를 수용하는 원발성 섬모(primary cilia)를 가지고 있습니다. 일차 섬모는 배아 신경 발달 중 음파 고슴도치 경로를 포함한 여러 발달 경로의 활동을 결정하고 성인 신경 세포 기능 동안 구획화된 세포 내 신호를 촉진하는 기능도 합니다. 당연히, 일차 섬모의 생물 발생 및 기능의 결함은 뇌의 발달 이상, 중심 비만, 학습 및 기억 결핍과 관련이 있습니다. 따라서 1차 섬모의 생물 발생과 섬모 이동을 신경 줄기/전구 세포 및 분화된 뉴런의 맥락에서 연구하는 것이 필수적입니다. 그러나 1차 뉴런에 대한 배양 방법은 상당한 전문 지식이 필요하며 동결-해동 주기에 적합하지 않습니다. 이 프로토콜에서는 1차 신경구를 사용하여 신경 줄기/전구 세포의 혼합 집단에 대한 배양 방법에 대해 논의합니다. 신경구 기반 배양 방법은 1차 신경줄기세포/전구세포를 연구하는 데 있어 여러 계대 및 동결-해동 주기에 대한 민감성, 뉴런/신경교세포로의 분화 가능성, 형질주입 가능성과 같은 이점을 제공합니다. 중요한 것은 신경구 유래 신경줄기세포/전구세포와 분화된 뉴런이 배양에서 섬모화되고 이러한 구획에서 섬모 기능과 관련된 신호 분자를 국소화한다는 것을 확인했습니다. 이러한 배양을 활용하여 신경 줄기/전구 세포 및 분화된 뉴런에서 섬모 형성 및 섬모 이동을 연구하는 방법을 추가로 설명합니다. 이러한 신경구 기반 방법을 통해 신경 줄기/전구 세포 및 분화된 뉴런의 맥락에서 G 단백질 결합 수용체 및 음파 고슴도치 신호 전달을 포함한 섬모 조절 세포 경로를 연구할 수 있습니다.
서론
일차 섬모는 미세 소관 기반의 동적 세포 내 구획하다는 태아 신경원 발달 (1, 2) 동안 소닉 헤지 호그 (쉬) 경로를 비롯한 세포 신호 전달 경로를 조정 감각 안테나, 성인 신경 기능 3 실형 세포 내 시그널링 4로서 기능 . 예 5 패치 (patch) 쉬 수용체 이들 경로의 구성 요소를 시그널링; 통로 활성제 평활화 (SMO) 6; 및 Gpr161 7 부정적인 쉬 경로를 조절 고아 G 단백질 연결 수용체 (GPCR)가 동적 방식으로 속눈썹에 지역화. 다수의 GPCR은 10 뇌 7, 8, 9에서 신경 세포의 섬모에 지역화보고되었다 SUP> 11,
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프로토콜
성인 마우스 뇌에서 neurosphere를 1. 분리
- 이소 플루 란의 과다 복용으로 (약 2 개월) 성인 마우스를 안락사. 마우스가 호흡을 중단하고 사망 직후 해부 것을 다시 확인.
- 가위를 사용하여 두개골을 열 수있는 중간 선 절개를합니다. 뇌를 제거합니다.
- 얼음에 10cm 접시에 차가운 PBS의 뇌를 놓습니다. 측뇌실 48에서 SVZ를 얻기 위해 전체 마운트 박리 방법을 따른다.
- 1.5 ㎖의 튜브에 측뇌실 배치 PBS에 0.05 % 트립신 EDTA 500 μL를 추가하고, 수욕에서 37 ℃에서 15 분 동안 튜브를 배양한다.
- 15 분 후, 정지 배지 500 μL를 추가 부드럽게 피펫 20 - 1 mL의 팁 30 회. 피펫 팅하는 동안 공기 방울을 형성하지 마십시오.
참고 :이 단계는 세포 생존에 중요합니다. - 8 분 동안 500 XG에서 세포를 스핀 다운. 상등액을 버리고 PBS 1 mL를 넣어 재현 탁의 t완만 한 ML 팁 배를 피펫 팅 그 세포.
- 8 분 동안 500에서 스핀 다운 XG. 1 mL의 팁을 사용하여 상층 액을 제거하고 기본 배지 1 ㎖를 추가한다.
- (선택) 세포 파편이 관찰되면....
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결과
일주일 NSC 매체에 SVZ에서 세포 도금 후 부동 neurosphere를는 (도 2A)를 관찰 하였다. 구체의 크기는 50 ~ 200㎛ 사이에서 변화. 구체는 신경 줄기 / 전구 세포에서 파생 된 경우 검사하려면 neurosphere를가 PLL-과에 도금 된 2 일 동안 NSC 매체의 커버 슬립을 라미닌 코팅. 그들은 다음 신경 줄기 / 전구 세포 마커, 네 스틴에 대한 면역 염색되었다. 이틀은 구체가 커버 슬립에 부착하고 세포의 단층으로 성장 할 수 있도록 필요했다. 세포의 단층은 네 스틴 (도 2B)에 양성이었다. neurosphere를의 분화 능력을 검사하기 위해, 우리는 PLL-과에 2 장에 설명 된 단계에 따라 그들을 도금 7~10일에 대한 분리하지 않고 차별화 매체에서 커버 슬립을 라미닌을 코팅. 그것은 차별화를 위해 적어도 일주일에 걸립니다. neurosphere를은 커버 슬립에 부착 확장에드는.......
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토론
여기, 우리는 생성하고 성인 마우스 SVZ에서 neurosphere 문화를 유지하는 방법을 설명합니다. 다음과 같이 문화에 관한 몇 가지 관련 사항입니다. 200 μm의 - 먼저, 구의 크기는 일반적으로 50 사이이다. neurosphere 직경보다 큰 300 μm의를 가져 우리의 경험에서, 계대을위한 최적의 시간이 누락되었습니다. 이 큰 분야는 핵심에있는 죽은 세포가 포함되어 있습니다. neurosphere를 일반적으로 신경 줄기 / 전구 세포를 연구하는 데 사용됩니다 둘째, 이들 세포의 stemness를 유지하기 위해 EGF와 FGF-기본 (bFGF를)를 사용하는 것이 중요합니다. 따라서, FBS로 분화를 유도 요인, neurosphere를 유지하는 동안 피해야한다. 10 % FBS가 아스트로 사이트 (47)에 neurosphere를 구별 할 수 있음을 보여왔다. 셋째, 신경 세포의 분화 정도는 마우스의 나이에 따라 다릅니다 수 있습니다. 하나 neurosphere를 더 많은 신경.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
S.M. 실험실에서의 연구는 CPRIT (R1220) 및 NIH (1R01GM113023-01)의 모집 보조금으로 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 12mm 라운드 커버 유리 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24웰 플레이트 | Falcon | 353047 | |
| 4% 파라포름알데히드(PFA) | Affymetrix | 19943 | |
| 50 mL 튜브 | Falcon | 352098 | |
| 95 mm x 15 mm 페트리 접시, 미끄러질 수 있는 뚜껑 | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm 접시 |
| 70 µ m 세포 여과기 | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure 당나귀 안티 토끼 IgG (H + L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | 당나귀 안티 토끼, Alexa 488 2 차 항체 |
| Arl13B, 클론 N295B / 66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 보충제 (50X), 무 혈청 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| 원심 분리기 | Thermo scientific | ST 40R | |
| 극저온 바이알 | 코닝 | 430488 | |
| DAPI | 시그마 | D9542-10MG | |
| 소 췌장에서 추출한 데옥시리보뉴클레아제 | I 시그마 | D5025-15KU | Dnase I |
| 디메틸 설폭사이드 | 시그마 | D8418-100ML | DMSO |
| 일회용 비닐 표본 금형 | 사쿠라 티슈-텍 크라이오몰드 | 4565 | 10 mm x 10 mm x 5 mm |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수 10X, 수정됨, 염화칼슘 및 염화마그네슘 없음, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합 | Sigma | D1408-500ML | DPBS |
| Dumont #5 집게 | Fine science tools | 11254-20 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G 솔루션 | Southern Biotech | 0100-01 | 마운팅 솔루션 |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| 염소 안티 마우스 IgG1, 2차 항체, Alexa Fluor 555 접합체, | ThermoFisher Scientific | A-21127 | 염소 안티 마우스 IgG1, Alexa 555 2차 항체 |
| 염소 안티 마우스 IgG2a, 2차 항체, Alexa Fluor 555 접합체 | ThermoFisher Scientific | A-21137 | 염소 안티 마우스 IgG2a, Alexa 555 2 차 항체 |
| Gpr161 | 집에서 만든 | N / A | |
| 인간 bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| 혈구계 | Hausser Scientific | 0.100 mm 깊이 | 개선 된 neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | |
| Engelbreth-Holm-Swarm 육종 기저막 | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection 시약 | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
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| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
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| OCT 페니실린-스트렙토마이신 | 시그마 | P4333-100ML | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P4707 | |
| 재조합 인간 EGF 단백질, CF | R 및 D 시스템 | 236-EG-200 | EGF |
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참고문헌
- Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet.
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