Summary
我々は、in vivoでのライブ生物発光およびSJL / Jマウスにおける多発性硬化症の実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおける視神経炎や脳炎の近赤外イメージングのための技術を示します。
Abstract
SJL / Jマウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、再発寛解型多発性硬化症（RRMS）のモデルです。運動機能障害を記述する臨床EAEスコアは、脊髄の免疫媒介炎症の基本的な読み出しです。しかし、スコアおよび体重は脳の炎症と視神経炎のin vivoで評価することができません。後者は、約2/3のMS患者の早期かつ頻繁な症状です。ここでは、 インビボイメージングシステムを用いて、生きているマウスにおける生物発光およびEAEの視神経炎を誘発評価するための近赤外ライブイメージング、脳の炎症、及び血液脳関門（BBB）破壊するための方法を示します。酸化酵素によって活性化された生物発光基質は、主に視神経炎を示しました。信号は特異的であり、臨床スコアを並列薬の効果や病気の時間のコース、の可視化を可能にしました。 vasculatur内に留まったペグ化蛍光ナノ粒子長時間eがBBBの完全性を評価するために使用しました。近赤外イメージングは、疾患のピーク時BBB漏れを明らかにしました。信号は、目の周りの最も強かったです。マトリックスメタロプロテアーゼのための近赤外基質は、EAE誘発炎症を評価しました。自家蛍光は、定量化のためのスペクトルアンミキシングを必要とし、信号を妨害しました。全体として、生物発光イメージングは、EAEに関連する視神経炎および薬物の効果を評価するための信頼性の高い方法であり、シグナルの特異性、堅牢性、定量化の容易さ、及びコストの観点から近赤外の技術よりも優れていました。
Protocol
SJL / Jマウスにおける1 EAEの誘導
- マウス
- 11週齢の雌SJL / Jマウスを使用し、それらは約7日間の実験室に馴化することができます。グループあたりのn = 10匹のマウスを使用してください。
- 薬物の効果を評価するために、免疫後3又は5日出発連続飲料水を介してまたは餌ペレットを介して制御グループの薬物およびプラセボを投与する（群あたりn = 10）。疾患のピーク時には、牛乳または3％の砂糖水に浸したコーンフレークと薬またはプラセボを投与します。
- 予防接種材料
- 完全フロイントアジュバント（CFA、熱殺菌された結核菌H37 Ra）が2バイアル（各5μg）とエマルジョン中の抗原からなるEAE誘導キット（プロテオリピドタンパク質のペプチド、PLP139-151、1mg / mlのエマルジョン）を使用します凍結乾燥した百日咳毒素（PTX）の。
- すなわち、<; 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBSにPTX（2μg/ ml）を溶解させ/ em>の）、各PTXチューブにPBSの1.5 mLを加え、よく混ぜ、同じピペットチップで除去し、50 mLチューブ中の1mLのPBSに追加します。よく混ぜます。
- 免疫
- 尾の基部に、2箇所にそれぞれ100μL、両方をPLP / CFAの皮下に注入します。背中上部または首の皮膚内の任意の免疫反応が頭のイメージングおよび脊髄の障害になるので、首の後ろに注入しないでください。
- 免疫後2時間および24時間で二 - 、二回マウス当たり、腹腔内（ip）第1のPTXの100μLを注入します。
- 対照マウスでは、PLPなしPLPなしCFA（100μLの2箇所）を加えたPTXを注入します。
- マウスは免疫後の取り扱い
- 7日目に一日おきにマウスを計量し、その後、毎日それらの重量を量ります。
注：マウスは約1失う - EAE間に体重を2g。減少は、EAEの発症をマーク。 - 7日目アコードから毎日臨床症状を評価します運動機能に明らかな変化を、0.5スコア：標準スコアリングシステムにる（ すなわち、スコア0ない尾の先端麻痺を;スコア1：完全な尾の麻痺を、1.5スコア：1または両方の後肢の軽度の不全麻痺;スコア2：後ろ足の深刻な麻痺;スコア2.5：1後肢の完全麻痺;スコア3：両方の後肢の完全麻痺; 3.5スコア：後肢と1前脚の麻痺の完全な麻痺が3.5以上のスコアのためにマウスを安楽死させます> 12時間。
- 7日目に一日おきにマウスを計量し、その後、毎日それらの重量を量ります。
- EAEコースや撮影時
- 免疫後12 - マウスは10日目の周りに発生するスコア> 1に達したときに、疾患の発症時に最初の撮影を行います。
- 3日 - 初期症状が発症する1または2日後に到達され、1持続しますピーク時の第2の撮像を実行します。
注：その後、マウスは完全に7〜10日以内に回復します。インターバル中のイメージングは、依然として、血管の漏れを示すことができますしかし、炎症の指標が負でなければなりません。
2.生物発光と視神経炎と脳炎症の近赤外イメージング
- イメージング・システムのセットアップ
- 生物発光と近赤外信号の解析を可能にする機器をin vivoイメージングに行います。
- 全てのイメージング手順の間に2.5％イソフルラン麻酔 - 2の下にマウスを保管してください。
- 中央のガス供給を使用して、装置内で互いに横に位置1または2匹のマウス。中心部の上部脊椎を置きます。
- 薬の効果の評価は、ペアを比較するために、同時に2匹のマウス、グループごとに1つを使用してください。これは、生物発光イメージングのために重要です。
- 黒い布を用いた免疫化の部位を遮蔽し、マウス/マウスの正確な位置決めを評価するために写真とベースライン画像を取ります。すべての画像のためのカメラに6.5 cmの距離でB-フォーカスを使用してください。
- 生物発光炎症プローブの注射とイメージング
- in vivoイメージングシステム設定を使用：8ビニングエピBLIは、エムがオープンフィルタリング、例のフィルタブロック、FSTOP 1、B = 6.5センチメートル、広告露出120秒を集中。ベースライン画像を取ります。
- すぐに使用できる化学発光試薬（40ミリグラム/ mL）を100μLの腹腔に注入します。注射器を充填する前によく混ぜます。
- 生物発光画像5、10、および注射後15分をキャプチャします。生物発光ピークの時間経過は、動物間で異なります。
注：ピークは5発生します - 注射後の10分。 15分での減少はそれ以上の画像が必要とされないことを示しています。異なる時間のコースのためにマイナーなバイアスを排除するためにコントロール群と処置群のマウスのペアを使用してください。 - 実験に関連する説明を記入します。自動的にポップアップダイアログボックスを観察し、そのようなマウス系統、性別、時刻、プローブ注射、グループなどの時間などの情報を含みます。ファイルのすべての中のOを保存neのフォルダ;彼らは、時間タグとすべての記述があります。
- BBBの整合性のための近赤外蛍光ナノ粒子の注射とイメージング
- B-フォーカス（：6.5センチメートル距離）に近赤外落射蛍光イメージングを使用してください。ペグ化蛍光ナノ粒子の励起/発光最大値は690分の675 nmです。 Ex640 / Em700およびEx675 / Em720で、異なる波長で2つの画像をキャプチャ。 8ビニング2-のエクスポージャーを、使用、およびFSTOP 2は、ベースライン画像を取ります。
- 尾静脈を介してペグ化された蛍光赤外線ナノ粒子の70μLの静脈注入し、マウスを3時間と、上記の設定を使用して、注射後24時間を想像してみてください。注射器を充填する前に、溶液をよく混ぜます。
- シグナルの特異性を評価するために必要とされる対照マウスにおける0.9％塩化ナトリウム、注射。
- 注入及びMMP活性の近赤外蛍光プローブのイメージング
- 剃るか、頭を脱毛するとuベースライン画像を撮影する前に、慎重に1日PPERの脊椎領域。皮膚が負傷してはいけません。
- B-フォーカス（：6.5センチメートル距離）に近赤外落射蛍光イメージングを使用してください。 MMPの活性化プローブの励起/発光最大値は700分の680 nmです。 Ex640 / Em700およびEx675 / Em720で、異なる波長で2つの画像をキャプチャ。 8ビニング1-sの露出を、使用、およびFSTOP 2は、ベースライン画像を取ります。
- それは、10匹のマウスのために十分になるようにすぐに使用できる溶液（1×PBS中で20ナノモル/ 1.5 mL）を1.5 mLチューブに1×PBSの200μLを加えます。注射器を充填する前によく混ぜます。
注：提供するボリュームは、いくつかのボリュームがシリンジ充填および注入中に失われていることを考慮に入れていません。 - 24時間イメージングの前に尾静脈を介してプローブivの150μLを注入します。シグナルの特異性を評価するためにのみ対照動物にPBSを注入します。
- 注射後24時間の時点で、少なくとも二つの波長、Ex640 / Em700および実施例675 / Eでエピ-FLの画像を撮影しますM720は、設定で（8、およびFSTOP 2ビニング1-sの露出、フォーカスB）上記で説明しました。
注：2波長の使用は、非特異的シグナルを差し引くことによって、スペクトルアンミキシングを可能にします。
3.画像の解析
- 生物発光分析（BLI）
- それを開くためにソフトウェアをダブルクリックします。
- 上部のメニューバーで、実験のフォルダのディレクトリに移動し、それを選択し、 ファイルブラウザのアイコンをクリックしてください。これは、テーブル内のフォルダ内のすべてのファイルを開きます。
- 実験に関連する記述を示す列を設定します。
- 品質管理のために、EAE信号の特異性を確認するために、EAEおよび/またはナイーブマウスの症状がなく、非レスポンダーマウスのファイルをダブルクリックします。
注：非応答マウスではないナイーブマウスの信号と最小の信号があってはなりません。- プロの注入前のベースライン画像をチェック信号の特異性のさらなる対照として、各マウスについてです。それが負でなければなりません。
- 画像を選択するには、最初のEAEマウスの最初のファイルをダブルクリックし、生物発光強度（LUTバー範囲）と局在を確認してください。すべての画像を一枚ずつ確認してください。各マウスの最安強度（ すなわち 、各マウスのための3つの画像のうち、2を保持）を使用してファイルを閉じます。
- 画像調整と輸出
- 定量化される最初のファイルをダブルクリックします。新しいウィンドウポップアップを確認します。 「オプション」（上部メニュー）の下では、各画像に表示するラベルをカスタマイズします。
- 右側のツールパレットでは、に行く「画像調整」。デフォルトでは、最小値と最大強度は、「オート」に設定されており、虹の擬似カラーで表示されています。必要に応じて設定を変更するには、「手動」を選択します。
注：たとえば、エクスポートされたすべての画像が簡単に匹敵する同一のLUTバー（同一の最小値と最大値）を有していてもよいです。最小値と最大値の調整は、定量的な結果には影響しません。 - 画像のエクスポート、選択PNG形式、ディレクトリ、およびイメージ名をクリックして
- 関心領域の定量化（ROI）
- ツールパレットで「ROI」ツールに移動します。 ROI法（円、長方形、自動、またはフリーハンド）とROIの数を選択します。画像ウィンドウでポップアップROIウィンドウを確認します。
- マウスを使用して、サイズと位置を調整します。自動ROIツールを使用する場合は、すべての画像に対して同一のROIのしきい値を使用します。 ROIのサイズと位置を手動で（ 例えば、円形のROI）が定義されている場合は、すべての画像に対して同一の領域を使用してください。
- RO.I.が新しいウィンドウポップアップを観察し測定する」をクリックします。列をカスタマイズする（ 例えば、ファイル名、動物番号、グループ、実験、面積、総カウント、平均カウント、SD数、minとmaxはカウント、面積、時間ポイント、プローブ注入など ）の時間。カスタマイズされた設定を保存します。場合には、再ADYは、全てます（Ctrl + A）を選択し、スプレッドシートに表をコピーして貼り付けます。
- 代わりにROIを持つPNGなどの画像をエクスポートします。保存した画像ファイルを閉じます。
- 定量化する必要があるすべての画像ファイルのために - （3.1.7 3.1.6ステップ）の手順を繰り返します。スプレッドシートにすべてのROIの定量化をコピーします。
注記：ここでは、結果等のグループ、時刻によってソートされ、統計的に分析することができます。統計分析のためのROIにおける生物発光シグナルの合計カウントを使用してください。
- 蛍光ナノ粒子の近赤外（NIR）分析
- ソフトウェアのコントロールを使用して、画像のしきい値を調整します。
注：これは、定量的な結果には影響を与えません。 - 視覚信号の特異性を評価するために、EX /エム720分の675及びEX /エム700分の640で撮影した画像を比較します。
- 定量分析のためにEX /エム720分の675で撮影した画像を使用してください（最大励起：680 nm）を。自動ROIツールを使用することができるためのROIを規定します。自動ROIのしきい値を調整し、すべての画像のためにそれを使用しています。関心領域内の総放射効率を定量化する（ステップ3.1参照）。
- ソフトウェアのコントロールを使用して、画像のしきい値を調整します。
- プロテアーゼ感受性プローブの近赤外（NIR）分析
- ソフトウェアのコントロールを使用して、画像のしきい値を調整します。
注：これは、定量的な結果には影響を与えません。自家蛍光のスペクトルアンミキシングを行います。アンミキシングツールはイメージリビングに実装されます。自動アンミキシングは、自家蛍光画像などの特定および720分の675としてEX /エム700分の640を使用しています。 - 混合されていない画像を選択し、上記のように、関心領域を定義します。定量的および統計分析のためのROI内の総放射効率を使用してください。
- ソフトウェアのコントロールを使用して、画像のしきい値を調整します。
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Representative Results
視神経炎の生物発光の時間コース
炎症プローブの生物発光信号は、目の周りの最も強かったと視神経炎でEAEマウスでのみ発生しました。信号は非EAEマウスや炎症プローブを注入していないマウスでもないに発生しました。マウスが回復したときに信号が消失しました。したがって、信号は、視神経炎に特異的であり、信号のピークが臨床EAEスコアのピークに匹敵します。 図1は 、EAE誘導後10日目および14で撮像されたSJL / Jマウスの2つの例を示しています。生物発光シグナルは、10日目で最高だったとマウスが回復し始めたときに姿を消しました。臨床スコアの時間コースは生物発光シグナル（例-1）またはスコアの前に（例-2）下落の消失と一致しました。
図1.視神経炎とEAS-SJL / Jマウスにおける臨床スコアの時間コース。視神経炎の生物発光画像は、免疫後の異なる時点で2 SJL / Jマウスにおける疾患の1 番目のフレア中の炎症プローブ（100μLの腹腔内）の注射後10分を捕捉しました。生物発光画像（左パネル）は10日および14日の免疫化後に捕捉したと虹の疑似カラー写真オーバーレイとして提示されています。 LUTバーは、赤（高生物発光）に青（低）の範囲です。スケールバー：1 cmです。右側のパネルには、関心領域内の個々の総生物発光カウントの棒グラフ（3枚毎の平均±SD）および臨床EAEスコアの経時変化を示しています。赤い矢印は、撮影日をマーク。 大きい方がまし表示するには、こちらをクリックしてください。この図のrsion。
治療有効性の評価
炎症プローブ
薬物（R-フルルビプロフェンを5mg / kg /日）5の効果は、 図2に示されています。各グループの生物発光画像の5つの例が提示されています。車両と治療群ではスコアは不均一であったが、全てのマウスにおいて、視神経の炎症を示す眼の中の生物発光シグナルは、薬物療法群（ 図 2A）で低かったです。関心領域内の全生物発光カウントの定量化は、有意な治療効果が確認された（総生物発光カウントのボックスプロットで、 図2Bを 、対応のないt検定、P <0.05を2テイル）。撮像結果は、治療効果と一致しました臨床スコアおよび脊髄におけるEAEの組織病理学的症状および視神経5の観点で薬の秒。
図生物発光イメージングを使用したEAE-SJL / Jマウスにおける薬物の2.効能。 SJL / Jマウスは免疫後5日目から車両または薬物療法（R-フルルビプロフェンを5mg / kg /日）を受けました。画像は、n = 10のグループごとに、1 回目のEAEピーク時の炎症プローブ（100μLの腹腔内）の注射後に捕獲されました。 EAEは、両群で7/10に開発され、EAE非応答は、信号なしでした。虹の疑似カラー写真オーバーレイとして提示されている炎症プローブの100μLの腹腔内注射後15分- A）生きたマウスにおける生物発光画像は、5を捕獲しました。 LUTバーは、赤（高輝度）に青（低）の範囲です。スケールバー：1 cmです。個々のピーク関心領域内の全生物発光数の定量化のために使用しました。 ROIは、ヘッドに制限されていました。 PLPの注射部位は、黒い布でシールドされました。 B）のROI内の全カウントの定量化を示すボックスプロット。ボックスは四分位範囲を表し、線は中央値であり、ウィスカは、最大最小値を示しています。総カウントは、薬物療法を受けたマウスでの視神経炎や脳炎の減少を示す、群間で有意（両面対応のないt-検定、P <0.05）が異なっていました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ペグ化蛍光ナノ粒子
近赤外ナノ粒子のエピ蛍光画像は、両方の治療grouで目の周りと脳内の血管の漏れが明らかになりましたPS（ 図3A、2例）。粒子は、染料がBBBの完全性の評価を可能にする、蓄積する炎症の部位を除いて、間質空間への血液から非常にゆっくりと配布します。漏れは、ナノ粒子の注入後3時間および24時間で明らかであったが、それは、後の時点で強かったです。ナノ粒子（右パネル）を注入していない非EAEマウスまたはマウスには特異的なシグナルはありませんでした。したがって、信号は特異的でした。関心領域における放射効率（ 図3B）の定量分析は、処置群（群当たりn = 3、不対2テールt検定、P <0.05）の間で有意差を示しませんでした。
図3.ペグ化蛍光ナノ粒子と血液脳関門の破壊の評価。 SJL / Jマウスは、車両や薬物療法（R-flurbiprofを受けました免疫後5日目から5ミリグラム/ kg /日）が備わっています。画像は3時間と近赤外標識ナノ粒子の注射後24時間（70μLⅳ）第一EAEのピーク時に、群当たりn = 3を捕捉しました。 EAE非応答は、信号なしでした。自動ROIツールは、放射効率の定量化のために使用しました。 ROIは、ヘッドに制限されていました。 PLP注射部位を遮蔽しました。 A）生きているマウスの代表的なエピ蛍光画像は、ナノ粒子の注射後3時間および24時間を捕獲しました。 EAEなしまたはナノ粒子を注射せずにマウスの画像が撮像対照として使用しました。スケールバー：1 cmです。 LUTバーは暗赤色（低）、黄色（高輝度）の範囲です。 B）棒グラフは、（）平均値±SDのROIにおける放射効率の定量化を示します。治療群が有意（両面対応のないt-検定）で差がなかったです。 Vにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版をIEW。
マトリックスメタロプロテアーゼに敏感なプローブ
自家蛍光を差し引いた後、プロテアーゼ活性化MMPプローブの画像は、脳およびEAEマウスの脊髄（ 図4A、グループ当たり4匹のマウスの例）に炎症を明らかにしました。そこにプローブを注入していないマウスには信号はなかった、と弱い信号が臨床症状（非応答）することなく、EAEマウスで発生しました。 図4の画像は、EX /エム720分の675で画像を差し引いEX /エム700分の640での信号を示しています。治療間の相違点のみのスペクトル非混合した後、自動のROIにおける放射効率の定量分析した後に明らかにした（ 図4B、対応のないt検定を2尾の、nは6,4、P <0.05 =）。
ジル/ ftp_upload / 55321 / 55321fig4.jpg "/>
近赤外MMP-敏感なイメージングプローブとのメタロプロテアーゼ活性の図4.評価。 SJL / Jマウスは免疫後5日目から車両または薬物療法（R-フルルビプロフェンを5mg / kg /日）を受けました。画像は、PLPの注射部位が遮蔽された第一EAEのピーク時（150μLⅳ）プローブの注射の24時間後に撮影し、N = 6と4ました。 MMPプローブ注射なしEAE非応答マウスを対照として使用しました。各2画像はEX /エム700分の640 nmの（特定の信号）と、720分の675 nmの（自家蛍光）で捕獲されました。スペクトルアンミキシングツールを使用して、自家蛍光を減算し、続いて、自動ROIツールは、特定のMMPの活性部位を同定するために使用しました。総放射効率を定量するために使用しました。 A）生きているマウスにおける代表的な落射蛍光画像は、プローブ注射後24時間を捕獲しました。画像は、スペクトルアンミキシング（UMX）の結果です。スケールバー：1 cmです。 LUTバーsが暗赤色（低）から黄色（高輝度）の範囲にあります。 B）のROI中の総放射効率の定量化を示すボックスプロット。ボックスは四分位範囲を表し、線は中央値であり、ウィスカは、最大最小値を示しています。アスタリスクは群間の有意差（2-両側不対t検定、P <0.05）を示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
現在のビデオは、SJL / JマウスにおけるEAEのin vivoイメージングにおける生物発光と近赤外蛍光のための技術を示しています。我々は、炎症感受性プローブを用いた生物発光イメージングは、主に視神経炎を示し、そして定量化はEAEの重症度の臨床評価および薬物の効果と一致することを示します。信号は脊柱によって吸収されるためしかし、生物発光イメージング法は、おそらく、EAEの症状17の主要部位である腰部脊髄の炎症を検出することができませんでした。
近赤外イメージングはより敏感であるが、生物発光発生しません自己蛍光、との高い干渉を犠牲にして。 NIR急速に変化する信号強度を持つ時系列のための好ましい方法になります - （5分2）、BLIと比較して - （2の1）NIRの露光時間ははるかに短いです。
との重要なステッププロトコルおよび技術の限界で
予防接種のサイトの信号は、EAEにおける脊髄イメージングを妨害するが、これはお勧め注射部位（首と尾の付け根）に劣っていなかった、尾の基部に両方の注射部位を配置することによって回避することができます。それにもかかわらず、黒い布で注射部位を遮蔽する必要があります。
反応速度は、動物間で異なるので、生物発光イメージングのために、画像の時系列を捕捉するために重要です。動力学に起因するバイアスを回避するために、制御（ 例えば、車両または野生型）およびverum（ 例えば、薬物またはトランスジェニック）マウスのペアのイメージングが有利です。製造業者によると、信号は30分間安定であるべきです。 10分および15分での大幅な減少 - しかし、EAEに、我々は5で発生するピークで、より速く、より一過性の動態を観察しました。
近赤外イメージングのために、manufacturerは、特定のプローブの例/エムの設定をお勧めします。それにもかかわらず、最初にフィルタシリーズを実行するのに有用であり、常に少なくとも密接に報告EX /エム極大に一致し、後非特異的信号のスペクトル非混合のために使用することができる2つの励起/発光組み合わせで画像をキャプチャします。
光と蛍光が非常に黒い毛に吸収されるので、SJL / Jのように、白いマウスを使用することが重要です。ブラックマウスは慎重に撮影前に1日、後頭部に剃毛し、する必要があります。彼らは、炎症性スポットとして表示され、脳や脊髄のイメージングを妨害するため、皮膚病変は、避けなければなりません。 NIRイメージングのために、製造業者はすべてのマウスでも、白いマウスの脱毛をお勧めします。でもシェービング後、黒のマウスにおける頭部とバックの結果は白マウス（図示せず）を持つ未満説得力でした。 C57BL6マウスにおける一次進行型EAEモデルの場合は、市販されている白のC57BL6マウスは、ALTERすることができますネイティブ。 （： - 1 0.5最大スコア）これらのマウスはアルビノの遺伝的背景を持っていると確実にEAEを発症しないので、毛のない、免疫応答性SKH1マウスは、EAE近赤外イメージングに有用ではなく、あります。これらのマウスにおける炎症のプローブを用いて生物発光イメージングは、毛包が失われた皮膚内のいくつかの炎症性スポット（図示せず）を明らかにしました。
プロテアーゼ活性のNIR画像は、脳および脊髄の炎症を明らかにしたが、シグナルは定量分析の前にスペクトルアンミキシングを必要とする、自己蛍光によって重ね合わせました。したがって、NIRイメージングは、生物発光イメージング未満堅調に推移しました、より高価でした。しかし、プロテアーゼ活性化可能なプローブの使用は、特にマトリックスメタロプロテイナーゼを標的とする薬物の評価のために有用であり得ます。
長所と短所
異なるイメージング技術の利用は無料であり、具体的な質問に取り組みます。 bioluminの利点escentイメージングは、手頃な価格（約20ユーロ/マウス）です。信号を妨害するオート生物発光の欠如;高い特異性;便利なip注射と画像解析。そして、堅牢性と信頼性。デメリットは、黒の毛皮や骨により長時間露光時間と信号吸収されています。
NIRの利点は、NIR標識プローブ、カスタムNIR標識、短い露光時間、および高感度の容易さのより広い利用可能です。 （ - 100ユーロ/マウス50）、毛皮、自家蛍光との強い干渉、および分析の前に、スペクトルアンミキシング処理や画像処理の必要による吸収欠点はコスト高です。
プローブの数は、それらが原因で免疫細胞の浸潤に炎症部位でアップレギュレートされる炎症誘発性酵素（ 例えば、ペルオキシダーゼまたはメタロプロテアーゼ）によって活性化されるので、炎症部位を検出が利用可能です。これらのプローブのいくつかは、canceを検出します腫瘍微小環境または腫瘍自体によって酵素の放出（ 例えば、MMP類）に免疫細胞の浸潤を実証RS。毛細管漏出に組織に蓄積プローブはBBBではなく、炎症および癌の他のサイトの中断を検出します。
既存の/代替方法に関して技術の意義
「イメージングプラス臨床口内炎」の組み合わせが優れていたの疾患の状態の評価と薬物効果の検出のための「唯一の得点」。目の周りの生物発光シグナルはまた、視神経5にミエリンの破壊および免疫細胞の浸潤を示した以前の病理組織学的研究と一致します。約MS患者の2/3は、視神経炎のエピソードを開発しています。これまで、拡散磁気共鳴イメージング（MRI）及びOPを除く生きたマウスで視神経炎を定量化するための信頼できる、非侵襲的な方法が存在しません技術的には18を要求しているticalコヒーレンストモグラフィー（OCT）、。 10月には、視神経19で自己免疫反応を示唆し、EAE時の網膜の変化と萎縮を示す方法として、EAEに導入されています。
それは深い麻酔を必要とするので、この原稿に記載された方法と比較すると、10月には、マウスの方が高いストレッサーです。読み出しは視神経19の直接可視化ではありません。
蛍光ナノ粒子の近赤外イメージングは、EAEおよびMSのもう一つの特徴であるBBBの破壊を視覚化するのに便利でした。 MRI 20、21に加えて、BBBの完全性のin vivoモニタリングのための非侵襲的方法は存在しません。実験的な薬や植物性の薬物療法は、特にバリア22を締め付けることによって作用するので、これは、非常に有用であろう、 24内に過剰なリンパ球動員を妨げるP> 23、。 BBBを介して白血球の付着または遊出を防止し、その漏出を減少させることMS処理25で効果的な戦略であり、ナノ粒子のイメージングは、候補薬剤の有効性を評価するのに役立ち得ます。これまでのところ、粒子が高価です。生体顕微鏡は、BBBの整合性26を可視化するために使用される別の技術であるが、それは通常、（ケタミンおよびキシラジンで例えば、）長期的な、深い麻酔を必要とするため、開頭術の再覚醒マウスを禁止し、それゆえ時間経過を解析防止します。しかし、生体顕微鏡は、in vivoイメージングでは達成できない細胞下のレベルに携帯で高解像度の画像を提供します。
テクニックをマスターした後、将来のアプリケーションや行き方
要約すると、イメージングTE単独の臨床スコアによって明らかにされていない部分にあった現在のビデオ助け疾患の個々のコースを評価すると、薬物の効果をモニターするために、で提示chniques。技術は、動物実験で交換、削減と洗練の3「R」の原則に同意すると便利なアドオンツール薬物研究です。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究はドイツ学術協会（CRC1039 A3）と研究助成プログラムヘッセン州の「LandesoffensiveツアEntwicklung wissenschaftlich-ökonomischerExzellenz」（LOEWE）、トランスレーショナル医学・薬理学TMPとそうでないクローネ-フレゼニウス財団研究センターによってサポートされていました（EKFS）、研究研修グループトランスレーショナルリサーチイノベーション - ファーマ（TRIP）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AngioSpark-680 | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | NEV10149 | Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity |
| MMP-sense 680 | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | NEV10126 | Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation |
| XenoLight RediJect Inflammation Probe | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | 760535 | Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation |
| PLP139-151/CFA emulsion | Hooke Labs, St Lawrence, MA | EK-0123 | EAE induction kit |
| Pertussis Toxin | Hooke Labs, St Lawrence, MA | EK-0123 | EAE induction kit |
| IVIS Lumina Spectrum | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | Bioluminescence and Infrared Imaging System | |
| LivingImage 4.5 software | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | CLS136334 | IVIS analysis software |
| Isoflurane | Abbott Labs, Illinois, USA | 26675-46-7 | Anaesthetic |
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