Aviär seminstation av Svabbprover Massage och isolering av DNA från spermier
Summary
Det här protokollet beskriver Svabbprover massage, en icke-invasiv manuell teknik för insamling av sperma från fåglar och DNA-extraktion från aviär sperma med en kommersiell utvinning kit med ändringar.
Abstract
Insamling av sperma kan vara användbar för en rad tillämpningar, inklusive studier på spermiernas kvalitet, spermier telomeren dynamics och epigenetik. Fåglar är utbredda ämnen i biologisk forskning och är idealiska för studier med upprepad spermier prover. Dock är några resurser tillgängliga för dem som vill lära sig att samla in och extrahera DNA från aviär spermier. Här beskriver vi Svabbprover massage, en mild, icke-invasiv manuell teknik för att samla aviär spermier. Även om denna teknik är etablerad i litteraturen, kan det vara svårt att lära av de tillgängliga beskrivningarna. Vi tillhandahåller också information för att extrahera DNA från aviär sperma med en kommersiell utvinning kit med ändringar. Svabbprover massage kan lätt användas på alla små – till medelstora manliga fågel i reproduktiv skick. Efter insamling, sperman kan användas omedelbart för motilitet analyser eller fryst för DNA-extraktion som efter det protokoll som beskrivs häri. Denna utvinning protokollet raffinerade för aviär spermier och har med framgång använts på prover som tagits från flera tättingar arter (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanusoch Turdus migratorius ) och en columbid (Columba livia).
Introduction
Fåglar är idealisk ämnen för studier på spermiernas kvalitet och konkurrens1, spermier telomeren dynamics2, epigenetik3och liknande ämnen, som de används i biologisk forskning och spermier kan avsmakas enkelt använda Svabbprover massage. Svabbprover massage är en mild, icke-invasiv manuell teknik för insamling av sperma från fåglar4,5,6. Upprepade prover kan erhållas lätt och inga speciella verktyg behövs, gör det enkelt att utföra i fältet eller lab. Även om Svabbprover massage har varit i bruk i årtionden, är det svårt att lära från de tillgängliga skriftliga beskrivningar. Denna publikation är avsedd att minska tiden och osäkerhet involverad i lärande Svabbprover massage.
Sperma som samlats från fåglar med hjälp av Svabbprover massage kan användas omedelbart för motilitet bedömning4,7 eller artificiell insemination8eller fryst för andra användningsområden såsom avancerade imaging och DNA-extraktion. Sperman prover från tättingar är små men innehåller tätt packade spermier. DNA extraheras med en kommersiell utvinning kit för enkelhet, med ändringar att övervinna specialiserade skyddande funktioner i spermier9. Efter extraktion, kan spermier telomerer mätas med qPCR10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en enkel och tillförlitlig metod för insamling av sperma från små och medelstora fåglar i reproduktivt aktivet villkorar och extrahera DNA från aviär spermier.
Protokollet beskrivs sperma DNA extraktion ändras från ett kit för enkelhet, men var raffinerad för användning på aviär sperma. Spermier är resistenta mot lys av standard utvinning kemikalier9,13, och sperma prov som tagits från tättingar är ganska…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Jose Noguera för tidig hjälp med Svabbprover massage, och Jeffrey Kittilson för lab stöd. Detta arbete stöds av en ND EPSCoR FAR0022429 award till BJH. Publikationen kostar var generöst stöds av NDSU Institutionen för biologiska vetenskaper.
Materials
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
- Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
- Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
- Carrell, D. T. Epigenetics of the male gamete. Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).
- Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
- Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
- Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
- Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
- Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
- Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA ‘fingerprints’. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
- Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
- Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. . Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , (2016).
- . . QIAamp DNA Micro Handbook. , (2014).
- Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
- Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
- Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
- Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
- Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).
