这里介绍的是使用高数值孔径目标和全氟萘烷作为浸渍介质,用于高达3天的根和下胚轴发育的高分辨率共焦延时成像的简单技术。
植物发育的几个方面,如侧根形态发生,发生在几天的时间跨度。为了研究潜在的细胞和亚细胞过程,需要保持生理条件的高分辨率延时显微术策略。植物组织必须具有足够的营养和水供应持续的气体交换,但是当浸没并固定在盖玻片下时,它们特别易于缺氧。已经成功应用的一个策略是使用灌注系统来维持氧和营养物质的不断供应。然而,这种布置可能是复杂的,麻烦的,并且需要专门的设备。这里介绍的是一种使用全氟萘烷作为浸渍介质的简单成像系统的替代策略。该系统易于安装,需要最少的设备,并且易于安装在显微镜平台上,允许建立几个成像室并以标准形式成像等位基因。在该系统中,前两天,侧根生长速率与标准条件下的琼脂平板生长速率无差异,侧根生长以降低的速率持续至少另一天。植物组织通过琼脂板供应营养物质,其可用于施用一系列药理化合物。该系统被建立以监测侧根发育,但是容易适应于其他植物器官如下胚轴和主根的成像。
为研究植物发育基础的细胞和亚细胞过程,对高分辨率长期延时成像策略的需求不断增加。这种成像实验中的一个关键挑战是维持生理条件,包括充分的气体交换加水和营养物1,2,3 。为了利用具有高数值孔径的目标以获得最佳的光学分辨率,样本应位于紧密接近并且平行于盖玻片定向。在成像过程中,x,y和z方向的移动理想情况下最小。
虽然幼苗通常安装在水或水溶液中用于短期成像,但水具有低的溶解CO 2和O 2的能力(1.54mg / mL和0.04mg / mL,分别在20℃,0.1MPa) 4 ,这使得它不适合延长的延时实验。保持恒定水平的氧气和营养物质的灌注系统是解决这个问题的一种解决方案,并且已经开发用于共聚焦激光扫描显微镜(CLSM) 1,2,3和光敏显微镜(LSM) 5 。像RootChip 2和RootArray 3这样的系统专门设计用于发育根的时间推移成像,并且涉及在定制多标本装置中发芽种子。这些布置确保最小的机械扰动,并且被设计用于多个幼苗的并行分析,但是未被优化用于亚细胞结构的成像。 Calder及其同事设计了一种更复杂的基于灌注的成像腔室,其优化用于通过网状物将样品保持在适当位置的亚细胞结构成像允许使用高倍率浸没镜头1 。
这里提出的另一个简单的解决方案不是基于灌注系统,而是利用全氟碳酸盐(PFD),全氟碳化合物最近作为拟南芥成像6,7,8的成熟载体普及 。在这种应用中,用于溶解CO 2和O 2的PFD的高容量(PFD中的O 2为1.9g / mL,而在水中为0.04mg / mL) 9允许浸入的组织进行气体交换。此外,PFD是非荧光的,其折射率(1.313)与水(1.333)相当,并且比空气(1.000) 6更接近细胞质(〜1.4)。据报道,全氟化碳对各种植物和植物t具有最小的生理作用问题6 ,当浸泡在PFD中时,萝卜种子容易发芽,并在供水时呈现正常生长发育至少两整天。对拟南芥种子萌发进行了类似的观察。基于受激拉曼散射直接成像渗透后拟南芥叶组织中PFD的分布 ,Littlejohn及其同事得出结论,PFD可能不被活细胞吸收8 。 PFD以前主要用于成像空中组织,其中它显着地增加成像深度,因为它由于其低表面张力而容易地渗入空气空间6 。在这里,PFD被用于发展侧根的长期共焦成像。在该构造中,将一个或多个幼苗置于用琼脂固化并浸在PFD中的生长培养基板上。 PFD允许g在成像室内进行交换,防止缺氧。 PFD具有高挥发性,因此其也具有高气体渗透性的聚(二甲基硅氧烷)胶的垫圈(CO 2为1.5×10 -12 pmol m -1 s -1 Pa -1 ) 11保留。营养物和水由用琼脂固化的培养基板供应。同时,该琼脂板轻轻地将根部压在盖玻片上,从而将其相对位置固定在成像室中并允许使用高分辨率的水浸透镜。此外,琼脂板可用于施用一系列药理学治疗,包括地塞米松,谷维素和异恶草酮。成像室可以使用最少的设备从标准显微镜载玻片大量组装。成像室被开发和表征以研究侧根发育,但适用于成像其他幼苗器官,如主要根尖和下胚轴。
这里介绍的方法是一个简单的策略,用于高分辨率共焦成像的发展侧根,长达三天。对于长达48小时的时期,没有观察到成像系统对侧根发育的不利影响。 48小时后,平均侧根生长开始减慢,尽管大部分根(37%)继续以与平板根平均生长相当的速率生长。因此,通过成像足够大量的根,48小时后其生长减缓的根可被排除。成像室的系统测试在长于72小时的时间内不进行,但如果需要延长成像周期,建议使用替代策略。如果提供适当的环境条件,或者将其移除到生长设备并定期返回到显微镜,成像室可以连续留在显微镜台上。这允许多个室被平行成像/ P>
这里所述的腔室的一个优点是侧根固定在它们的位置,并且可以使用高分辨率水浸透镜成像。空间稳定性主要取决于支撑琼脂板中使用的琼脂浓度。最初测试了从0.8%琼脂到2%琼脂的一系列不同浓度的浓度,表明该范围内的高浓度稳定地固定在空间中的根,但是根生长速度更慢,一些根表现出机械应力的迹象,包括减少的细胞伸长。相比之下,在成像期间,低琼脂浓度没有提供所需的支持物和根部漂移在x,y和z中。最佳1.5%琼脂板固定样品的位置,无不良机械效应。在这些条件下,经过30分钟左右的时间,根在数小时内稳定,允许数据采集过夜。在采集4D数据期间,z堆叠范围通常为b另外还有5-10微米,但这主要是为了适应侧根的平面外生长而不是z漂移或摆动。尽管标准琼脂浓度提供了一些抗渗透性,但根深蒂固的根将最终渗入琼脂。然而,通过成像室的微小修改,根部生长可以保持平行于盖玻片,从而使较老的侧根和主根成像。此外,可以容易地为基底成像室定制下胚轴。下胚轴在该系统中更自由地浮动,使得用于图像采集的z轴支架通常增加到约20μm。在这项研究中,整个使用直立式显微镜,这使得可以控制基底特性。成像室可以适用于倒置显微镜配置,但是需要评估刚性盖玻片对截肢器官的时间依赖性影响。 </p>
Littlejohn及其同事指出,PFD本身不易溶解生物分子,这意味着它不能直接用于药物化合物的递送7 。通过将这些化合物通过琼脂板搁在其上的凝固生长培养基的板块来克服这个问题。虽然灌注系统仍然是洗出实验的首选方法,但是成像室已经成功地用于施用地塞米松12和其他化合物。一个注意事项,虽然这篇文章正在准备von Wagenheim及其同事18描述了使用光照片显微镜成像侧根发育的室。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢不列颠哥伦比亚大学Geoffrey Wasteneys教授的种子表达RFP-TUB6,还有一位匿名评审员进行了有用的修正。我们感谢Hugh Dickinson教授提醒我们使用纤维素膜作为机械支持,并向John Baker摄影。这项工作得到BBSRC研究资助BB / G013993 / 1和BB / D004055 / 1对IM的支持,BBSRC博士生培训奖和Clarendon奖学金
Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80mm disc |