Présenté ici, il s'agit d'une technique simple pour l'imagerie confocale temporelle à haute résolution du développement de la racine et de l'hypocotylie pendant jusqu'à 3 jours en utilisant des objectifs d'ouverture numérique élevée et la perfluorodécaline comme milieu d'immersion.
Plusieurs aspects du développement des plantes, comme la morphogenèse de la racine latérale, se produisent sur plusieurs périodes de temps. Pour étudier les processus sous-cellulaires et subcellulaires sous-jacents, des stratégies de microscopie temporelle à haute résolution qui préservent les conditions physiologiques sont nécessaires. Les tissus végétaux doivent avoir un approvisionnement en nutriments et en eau adéquat avec un échange gazeux soutenu, mais, lorsqu'ils sont immergés et immobilisés sous une lamelle, ils sont particulièrement sensibles à l'anoxie. Une stratégie qui a été utilisée avec succès est l'utilisation d'un système de perfusion pour maintenir un apport constant d'oxygène et de nutriments. Cependant, de tels arrangements peuvent être compliqués, encombrants et nécessitent un équipement spécialisé. Présenté ici, il existe une stratégie alternative pour un système d'imagerie simple utilisant la perfluorodécaline comme milieu d'immersion. Ce système est facile à installer, nécessite un équipement minimal et est facilement monté sur une étape de microscope, permettant de configurer et d'imaginer plusieurs chambres d'imagerie au pairAllel. Dans ce système, les taux de croissance de la racine latérale sont indiscernables des taux de croissance dans des conditions standard sur les plaques d'agar pendant les deux premiers jours, et la croissance de la racine latérale se poursuit à des taux réduits pendant au moins un autre jour. Les tissus végétaux sont alimentés en nutriments par une dalle de gélose qui peut également être utilisée pour administrer une gamme de composés pharmacologiques. Le système a été établi pour surveiller le développement de la racine latérale, mais est facilement adaptable à l'image d'autres organes végétaux tels que les hypocotyles et les racines primaires.
Pour étudier les processus cellulaires et subcellulaires qui sous-tendent le développement de l'usine, il existe une demande croissante de stratégies d'imagerie à long terme à haute résolution à long terme. Un défi majeur dans de telles expériences d'imagerie est le maintien de conditions physiologiques, y compris un échange gazeux suffisant, plus une réserve d'eau et de nutriments 1 , 2 , 3 . Pour utiliser les objectifs avec des ouvertures numériques élevées pour une résolution optique optimale, les spécimens doivent être positionnés à proximité et orientés parallèlement à la lamelle. Le mouvement dans les directions x, y et z devrait idéalement être minimal lors de l'imagerie.
Alors que les semis sont souvent montés dans une solution aqueuse ou aqueuse pour une imagerie à court terme, l'eau a une faible capacité à dissoudre CO 2 et O 2 (1,54 mg / mL et 0,04 mg / mL, respectivement à 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , ce qui rendIl est inadapté à des expériences prolongées. Les systèmes de perfusion qui maintiennent des niveaux constants d'oxygène et de nutriments sont une solution à ce problème et ont été développés à la fois pour la microscopie de balayage laser confocal (CLSM) 1 , 2 , 3 et la microscopie à lumière (LSM) 5 . Des systèmes comme le RootChip 2 et le RootArray 3 ont été conçus spécifiquement pour l'imagerie temporelle de développement de racines et impliquent la germination de graines dans un dispositif multi-spécimen personnalisé. Ces dispositions assurent une perturbation mécanique minimale et sont conçues pour l'analyse parallèle de semences multiples, mais ne sont pas optimisées pour l'imagerie des structures subcellulaires. Calder et ses collègues ont conçu une chambre d'imagerie à perfusion plus compliquée optimisée pour l'imagerie de structures subcellulaires dans lesquelles l'échantillon est maintenu en position par un maillagePour permettre l'utilisation de lentilles d'immersion à grand grossissement 1 .
Voici une solution alternative et simple à ce problème qui ne repose pas sur les systèmes de perfusion, mais utilise la perfluorodécaline (PFD), un perfluorocarbone qui a récemment gagné en popularité en tant que support de base pour l'image d' Arabidopsis 6 , 7 , 8 . Dans de telles applications, la capacité élevée de PFD pour la dissolution de CO 2 et O 2 (1,9 g / mL pour O 2 dans PFD par rapport à 0,04 mg / mL dans l'eau) 9 permet l'échange gazeux par le tissu immergé. En outre, le PFD n'est pas fluorescent et son indice de réfraction (1.313) est comparable à celui de l'eau (1.333) et est plus proche de celui du cytosol (~ 1.4) que l'air (1.000) 6 . On a signalé que les hydrocarbures perflucides avaient un effet physiologique minimal sur une variété de plantes et de végétauxProblèmes 6 , avec des graines de radis gerrissant facilement lorsqu'elles sont immergées dans la PFD et présentent une croissance et un développement normaux pendant au moins deux jours complets lorsqu'ils sont alimentés en eau 10 . Des observations similaires ont été faites pour germer des graines d' Arabidopsis 6 . Basé sur la diffusion estimée de Raman pour imaginer directement la distribution de PFD dans les tissus de feuilles d' Arabidopsis après l'infiltration, Littlejohn et ses collègues concluent que le PFD n'est probablement pas absorbé par les cellules vivantes 8 . Le PFD a déjà été utilisé principalement pour l'image des tissus aériens, où il augmente considérablement la profondeur d'imagerie car il infiltrait facilement les espaces d'air en raison de sa faible tension superficielle 6 . Ici, le PFD est adopté pour l'imagerie confocale à long terme du développement de racines latérales. Dans cette configuration, une ou plusieurs plants sont placés sur une plaque de milieu de croissance solidifiée avec de l'agar et immergée dans PFD. La PFD permet à gDans la chambre d'imagerie, empêchant l'anoxie. Le PFD est très volatil, de sorte qu'il est retenu par un joint d'étanchéité de gomme de poly (diméthylsiloxane) qui a également une perméabilité élevée aux gaz (1,5 x 10 -12 pmol m -1 s -1 Pa -1 pour le CO 2 ) 11 . Les nutriments et l'eau sont fournis par la dalle de milieu solidifié avec de l'agar. En même temps, cette dalle de gélose appuie doucement la racine contre la lamelle, fixant ainsi sa position relative dans la chambre d'imagerie et permettant l'utilisation de lentilles d'immersion à eau haute résolution. En outre, la dalle de gélose peut être utilisée pour administrer une gamme de traitements pharmacologiques, y compris la dexaméthasone, l'oryzaline et l'isoxabène. Les chambres d'imagerie peuvent être assemblées en grand nombre à partir de lames de microscopie standard en utilisant un équipement minimal. Les chambres d'imagerie ont été développées et caractérisées pour étudier le développement de la racine latérale, mais adaptées à l'imagerie d'autres organes de semis tels que des conseils de racines primaires etHypocotyls.
La méthode présentée ici est une stratégie simple pour l'imagerie confocale haute résolution du développement de racines latérales pendant deux ou trois jours. Pour des périodes allant jusqu'à 48 h, aucun effet néfaste du système d'imagerie sur le développement de la racine latérale n'a été observé. Après 48 h, la croissance moyenne des racines latérales a commencé à ralentir, même si un sous-ensemble important des racines (37%) a continué de croître à des taux comparables à la croissance moyenne des racines sur les plaques. Par conséquent, grâce à l'imagerie, un nombre suffisamment élevé de racines, les racines dont la croissance ralentit après 48 h peuvent être exclues. Les tests systématiques des chambres d'imagerie n'ont pas été effectués pour des périodes supérieures à 72 h, mais des stratégies alternatives sont recommandées si des périodes d'imagerie étendues sont souhaitées. Les chambres d'imagerie peuvent être laissées au stade du microscope en permanence, si des conditions environnementales appropriées sont fournies ou supprimées dans une installation de croissance et périodiquement retournées au microscope. Cela permet de créer de nombreuses chambres en parallèle. </ P>
Un avantage des chambres décrites ici est que les racines latérales sont fixées dans leur position et peuvent être imagées à l'aide de lentilles d'immersion à eau haute résolution. La stabilité spatiale dépend de manière critique de la concentration en gélose utilisée dans la brame de gant de support. Initialement, on a testé une gamme de concentrations différentes de 0,8% d'agar à 2% d'agar, ce qui révèle que les concentrations élevées dans cette gamme ont localisé des racines fixes dans l'espace, mais la croissance des racines a ralenti rapidement et certaines racines ont montré des signes de contraintes mécaniques, y compris une réduction de l'allongement cellulaire. En revanche, les faibles concentrations d'agar n'ont pas fourni le support requis et les racines dérivées dans x, y et z pendant l'imagerie. La dalle de gélose optimale de 1,5% corrige la position de l'échantillon sans effets mécaniques défavorables. Dans ces conditions, après la décantation dans les 30 premières minutes environ, les racines sont stables pendant plusieurs heures, ce qui permet une acquisition de données pendant la nuit. Lors de l'acquisition de données 4D, les plages de pile z étaient typiquement bRayonné de 5 à 10 μm supplémentaires, mais il s'agissait principalement de supporter une croissance hors-plan des racines latérales plutôt que de la dérive z ou de l'oscillation. Bien que la concentration en gélose standard offre une certaine résistance à la pénétration, les racines croit gravitropiquement finiront par pénétrer dans la gélose. Cependant, grâce à une modification mineure de la chambre d'imagerie, la croissance des racines pourrait être maintenue parallèlement à la lamelle, ce qui permet d'imaginer des racines latérales plus anciennes et des racines primaires. En outre, la chambre d'imagerie basique pourrait facilement être personnalisée pour les hypocotyles. Les hypocotyls flottent plus librement dans ce système, de sorte que le support de l'axe z pour l'acquisition de l'image a été augmenté habituellement à environ 20 μm. Dans cette étude, un microscope vertical a été utilisé partout, ce qui a permis de contrôler les propriétés du substrat. La chambre d'imagerie peut être adaptable aux configurations de microscope inversé, mais l'influence dépendante du temps de la lamelle rigide sur les organes d'interception devra être évaluée. </p>
Littlejohn et ses collègues ont souligné que le PFD lui-même ne dissout pas facilement les molécules biologiques, ce qui signifie qu'il ne peut pas être utilisé directement pour la distribution de composés pharmacologiques 7 . Ce problème a été surmonté en fournissant de tels composés à travers la dalle de milieu de croissance solidifié sur laquelle repose la dalle de gélose. Alors que les systèmes de perfusion resteront la méthode de choix pour les expériences de lavage, la chambre d'imagerie a été utilisée avec succès pour l'administration de dexaméthasone 12 et d'autres composés. Une note, bien que cet article soit en préparation von Wagenheim et ses collègues 18 ont décrit une chambre pour l'imagerie du développement de la racine latérale à l'aide d'une microscopie à la lumière.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Prof. Geoffrey Wasteneys, de l'Université de la Colombie-Britannique, pour la RFP-TUB6 exprimant les graines et un critique anonyme pour les corrections utiles. Nous sommes reconnaissants au Prof. Hugh Dickinson pour nous avoir informé de l'utilisation du film de cellulose comme support mécanique et de John Baker pour la photographie. Ce travail a été soutenu par des bourses de recherche BBSRC BB / G013993 / 1 et BB / D004055 / 1 à IM, et un prix de formation au doctorat BBSRC et Clarendon Scholarship à CK
Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80mm disc |