Presenterad här är en enkel teknik för högupplösning av konfokal tidsfördröjning av rot och hypokotylutveckling i upp till 3 dagar med höga numeriska bländningsmål och perfluorodekalin som ett nedsänkningsmedium.
Flera aspekter av växtutveckling, såsom lateral rotmorfogenes, uppträder på tidsintervaller av flera dagar. För att studera underliggande cellulära och subcellulära processer krävs högupplösningstid-lapse-mikroskopi strategier som bevarar fysiologiska tillstånd. Växtvävnader måste ha tillräckligt med näringsämnen och vattenförsörjning med långvarig gasutbyte, men när de nedsänks och immobiliseras under en täckglas är de särskilt mottagliga för anoxi. En strategi som framgångsrikt har använts är användningen av ett perfusionssystem för att upprätthålla en konstant tillförsel av syre och näringsämnen. Sådana arrangemang kan emellertid vara komplicerade, besvärliga och kräva specialiserad utrustning. Presenteras här är en alternativ strategi för ett enkelt bildsystem med användning av perfluorodekalin som ett nedsänkningsmedium. Systemet är enkelt att installera, kräver minimal utrustning och kan enkelt monteras på ett mikroskopsteg, vilket gör att flera bildkammare kan ställas in och avbildas i parallel. I detta system är laterala rottillväxthastigheter oskiljbara från tillväxten under standardbetingelser på agarplattor under de första två dagarna, och lateral rottillväxt fortsätter vid reducerade hastigheter under åtminstone en annan dag. Växtvävnader levereras med näringsämnen via en agarplatta som också kan användas för att administrera en rad farmakologiska föreningar. Systemet upprättades för att övervaka lateral rotutveckling men kan lätt anpassas till bild andra växtorgan som hypokotyler och primära rötter.
För att studera cellulära och subcellulära processer som ligger till grund för växtutveckling, finns det en ökande efterfrågan på långsiktiga time-lapse imaging strategier. En viktig utmaning vid sådana avbildningsförsök är att upprätthålla fysiologiska förhållanden, inklusive tillräcklig gasutbyte samt en tillförsel av vatten och näringsämnen 1 , 2 , 3 . För att utnyttja mål med höga numeriska öppningar för optimal optisk upplösning bör prover placeras i närheten och orienterade parallellt med täckglaset. Rörelse i x, y och z riktningar borde helst vara minimal under bildbehandling.
Medan plantor ofta monteras i vatten eller vattenhaltig lösning för korttidsbildning, har vatten en låg kapacitet för upplösning av CO 2 och O 2 (1,54 mg / ml respektive 0,04 mg / ml respektive 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , vilket görDet är olämpligt för förlängda tidsförloppsexperiment. Perfusionssystem som upprätthåller konstanta nivåer av syre och näringsämnen är en lösning på detta problem och har utvecklats för både mikroskopi (CLSM) 1 , 2 , 3 och ljusmikroskopi (LSM) 5 för konfokal laserskanning. System som RootChip 2 och RootArray 3 har utformats speciellt för tidsförskjutning av bildande av utvecklingsrötter och involverar groddfrön i en skräddarsydd flerprovsenhet. Dessa arrangemang säkerställer minimal mekanisk störning och är konstruerade för parallellanalys av flera plantor, men är inte optimerade för avbildning av subcellulära strukturer. Calder och kollegor har utformat en mer komplicerad perfusionsbaserad bildkammare optimerad för avbildning av subcellulära strukturer, där provet hålls i position med ett nätFör att tillåta användning av högförstoringsdämpande linser 1 .
Presenteras här är en alternativ, enkel lösning på detta problem som inte är baserat på perfusionssystem men använder perfluorodekalin (PFD), ett perfluorokarbonat som nyligen har blivit populärt som monteringsmedium för Arabidopsis-bildbehandling 6 , 7 , 8 . I sådana tillämpningar möjliggör den höga kapaciteten hos PFD för upplösning av CO 2 och O 2 (1,9 g / ml för O 2 i PFD jämfört med 0,04 mg / ml i vatten) 9 , gasutbyte genom nedsänkt vävnad. Vidare är PFD icke-fluorescerande och dess brytningsindex (1.313) är jämförbart med det för vatten (1,333) och är närmare det för cytosol (~ 1,4) än luft (1,000) 6 . Perfluorokarboner har rapporterats ha minimal fysiologisk effekt på en mängd växter och växter tUtfärdar 6 , med rädisfrön som lätt spricker när nedsänkt i PFD och uppvisar normal tillväxt och utveckling under minst två fulla dagar när den levereras med vatten 10 . Liknande observationer har gjorts för fröer av arabidopsis 6 . Baserat på stimulerad Raman-spridning för att direkt avbilda fördelningen av PFD i Arabidopsis bladvävnader efter infiltration, konstaterar Littlejohn och kollegor att PFD sannolikt inte tas upp av levande celler 8 . PFD har tidigare använts huvudsakligen för flygfotovävnader, där det väsentligt ökar bilddjupet eftersom det lätt infiltrerar luftutrymmen på grund av sin låga ytspänning 6 . Här antas PFD för långvarig konfokal avbildning av utvecklande laterala rötter. I denna konfiguration placeras en eller flera plantor på en platta av tillväxtmedium solidifierad med agar och nedsänkt i PFD. PFD tillåter gAseous utbyte i bildkammaren, förhindrande av anoxi. PFD är mycket flyktig så att den bibehålls av en packning av poly (dimetylsiloxan) gummi som också har hög gaspermeabilitet (1,5 x 10-12 pmol m -1 s -1 Pa -1 för CO2) 11 . Näringsämnen och vatten tillföres av plattan av medium solidifierat med agar. Samtidigt trycker denna agarplatta försiktigt mot roten mot täckglaset och fixerar därigenom sin relativa position i bildkammaren och tillåter användningen av högupplösta vattenlinser. Vidare kan agarplattan användas för att administrera ett antal farmakologiska behandlingar, inklusive dexametason, oryzalin och isoxaben. Bildkamrarna kan monteras i stort antal från standardmikroskopi diabilder med minimal utrustning. Bildkammare utvecklades och karaktäriserades för att studera rotationsutveckling i sidled, men kan anpassas till bildning av andra plantor, såsom primära rottips ochhypokotyler.
Metoden som presenteras här är en enkel strategi för högupplösande konfokalavbildning av utvecklande laterala rötter i två och upp till tre dagar. Under perioder upp till 48 timmar observerades inga negativa effekter av bildsystemet på sidodelutveckling. Efter 48 timmar började den genomsnittliga laterala rottillväxten sakta ner, även om en väsentlig delmängd av rötterna (37%) fortsatte att växa till priser som var jämförbara med genomsnittlig rottillväxt på plattor. Därför, genom bildbehandling ett tillräckligt stort antal rötter, kan rötter vars tillväxt sjunker efter 48 timmar uteslutas. Systematiska tester av bildkammare utfördes inte under perioder längre än 72 timmar, men alternativa strategier rekommenderas om förlängda avbildningsperioder önskas. Imagingkammare kan vara kvar på mikroskopsteget kontinuerligt, om lämpliga miljöförhållanden tillhandahålls eller avlägsnas till en tillväxtanläggning och periodiskt återföres till mikroskopet. Detta gör att många kamrar kan avbildas parallellt. </ P>
En fördel med kamrarna som beskrivs här är att laterala rötter är fixerade i sin position och kan avbildas med användning av högupplösta vattendämpande linser. Den rumsliga stabiliteten beror kritiskt på agarkoncentrationen som används i den bärande agarplattan. Inledningsvis testades en rad olika koncentrationer från 0,8% agar till 2% agar, vilket visade att höga koncentrationer i detta område stabilt fixerade rötter i rymden, men rotväxten avtog snabbare och vissa rötter uppvisade tecken på mekanisk stress, inklusive minskad cellförlängning. Däremot gav låga agarkoncentrationer inte det nödvändiga stödet och rötterna drev i x, y och z under avbildningen. Den optimala 1,5% agarplattan fixar provets position utan negativa mekaniska effekter. Under dessa förhållanden, efter avveckling under de första 30 minuterna, är rötterna stabila under många timmar, vilket möjliggör överföring av data över natten. Under förvärv av 4D-data var z-stackintervall typiskt bRacketed med ytterligare 5-10 μm men detta var huvudsakligen för att rymma out-of-plane tillväxt av laterala rötter snarare än z-drift eller wobble. Även om standard agarkoncentrationen ger viss resistans mot penetration, kommer gravitropiskt växande rötter så småningom att tränga in i agar. Genom en mindre modifiering av bildkammaren kunde dock rotväxten hållas parallellt med täckglaset, vilket möjliggör avbildning av äldre laterala rötter och primära rötter. Vidare kan den grundläggande bildkammaren lätt anpassas för hypokotyler. Hypokotyler är mer fritt flytande i detta system så att z-axelhållaren för bildupptagning ökades vanligtvis till ca 20 μm. I denna studie användes ett upprätt mikroskop överallt vilket medgav att substrategenskaperna kunde kontrolleras. Bildkammaren kan vara anpassningsbar till inverterade mikroskopkonfigurationer men det tidsberoende inflytandet av den styva täckglaset på avlyssningsorganen måste utvärderas. </p>
Littlejohn och kollegor har påpekat att PFD själv inte lätt löser upp biologiska molekyler, vilket innebär att den inte kan användas direkt för leverans av farmakologiska föreningar 7 . Detta problem övervinndes genom att tillhandahålla sådana föreningar genom plattan av stelnat tillväxtmedium på vilket agarplattan vilar. Medan perfusionssystemen kommer att förbli det val som föredras för uttömningsförsök har bildkammaren använts framgångsrikt för administrering av dexametason 12 och andra föreningar. En anteckning, medan denna artikel var under utarbetande, beskriver Wagenheim och kollegor 18 en kammare för bildbehandling av lateral rotutveckling med hjälp av ljusmikroskopi.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Prof. Geoffrey Wasteneys, University of British Columbia, för fröuttryck RFP-TUB6 och en anonym granskare för användbara korrigeringar. Vi är tacksamma för professor Hugh Dickinson för att varna oss för användningen av cellulosafilm som ett mekaniskt stöd och till John Baker för fotografering. Detta arbete stöddes av BBSRC forskningsbidrag BB / G013993 / 1 och BB / D004055 / 1 till IM, och en BBSRC doktorandutbildning och Clarendon Scholarship till CK
Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80mm disc |