ثقافة الكبار المعدلة وراثيا الزرد الشبكية إإكسبلنتس التصوير خلية حية من قبل Multiphoton المجهر
Summary
ومعظمها تم دراستها تجديد شبكية العين الزرد باستخدام شبكية العين الثابتة. ومع ذلك، والعمليات الحيوية مثل الهجرة النووية interkinetic تحدث خلال استجابة التجدد وتتطلب التصوير الخلية الحية للتحقيق في الآليات الكامنة. هنا، نحن تصف الظروف والثقافة وتصوير لمراقبة Interkinetic الهجرة النووية (الحركة الوطنية العراقية) في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر multiphoton.
Abstract
يبدأ برنامج تجديد الذاتية من قبل مولر الدبقية في الزرد الكبار (دانيو rerio) الشبكية التالية تلف الخلايا العصبية والموت. مولر الدبقية إعادة إدخال دورة الخلية وتنتج الخلايا الاولية العصبية التي تخضع لجولات لاحقة من انقسامات الخلية والتمايز إلى أنواع الخلايا العصبية المفقودة. كل من مولر الدبقية والخلايا الاصلية العصبية نوى تكرار الحمض النووي وتخضع الانقسام في مواقع متميزة من شبكية العين، أي أنها تهاجر بين القاعدية طبقة النووية الداخلية (INL)، وطبقة النووية الخارجي (ONL)، على التوالي، في عملية وصفت بأنها Interkinetic الهجرة النووية (الحركة الوطنية العراقية). وقد الغالب درست الحركة الوطنية العراقية في شبكية العين النامية. لدراسة ديناميات الحركة الوطنية العراقية في الكبار تجديد شبكية العين الزرد في التفاصيل، مطلوب التصوير الخلية الحية من مولر الدبقية الخلايا الاولية fluorescently المسمى / العصبية. هنا، ونحن توفير الظروف لعزل وشبكية العين الثقافة الظهريةمن تيراغرام [GFAP: nGFP] mi2004 الزرد التي تعرضت للضوء الشديد المستمر لمدة 35 ساعة. وتبين لنا أيضا أن هذه الثقافات الشبكية هي قابلة للتطبيق لإجراء تجارب التصوير الخلية الحية، والحصول بشكل مستمر الصور ض المكدس في جميع أنحاء سمك يزدرع الشبكية لمدة تصل إلى 8 ساعات باستخدام المجهر multiphoton لمراقبة سلوك الهجرة من GFAP: خلايا -positive nGFP . وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف تفاصيل لإجراء تحليل ما بعد التصوير لتحديد سرعة الحركة الوطنية العراقية قمي والقاعدية. لتلخيص، أنشأنا الظروف لدراسة ديناميات الحركة الوطنية العراقية في نموذج الكبار من تجديد الخلايا العصبية. هذا وسوف تقدم فهمنا لهذه العملية الخلوية حاسمة وتسمح لنا لتحديد الآليات التي تتحكم في الحركة الوطنية العراقية.
Introduction
وخلافا للبشر، الزرد (دانيو rerio) تبدي استجابة التجدد قوية على موت الخلية في الخلايا العصبية للشبكية 1، 2، 3، 4. عامل نخر الورم α، وهو جزيء إشارة التي يتم تحريرها من الموت الخلايا العصبية للشبكية يدفع مولر الدبقية المقيمين في القاعدية طبقة النووية الداخلية (INL) من شبكية العين، لتتكاثر 5 وإنتاج الخلايا الاولية العصبية التي لا تزال تتكاثر قبل التفريق في الخلية العصبية الأنواع التي توفي 2، 3، 4. خلال المرحلة التكاثري للاستجابة التجدد، نوى مولر الدبقية والمستمدة الخلايا الاولية العصبية التي تخضع لنمط الهجرة المتكرر في مرحلة مع دورة الخلية (Interkinetic الهجرة النووية، الحركة الوطنية العراقية) 6 </sup > 7. نوى المتمركزة في INL القاعدية تكرار الحمض النووي قبل أن يهاجر إلى طبقة النووية الخارجي (ONL) حيث أنها تقسم قبل العودة نوى الناشئة باسالي إلى INL. وقد وصفت هذه العملية لأول مرة خلال تطوير الظهارية العصبية باستخدام أساليب النسيجية، فيما أكد النهج التصوير الخلية الحية في وقت لاحق تفسير سوير 8، 9، 10، 11، 12. وقد استخدمت كلا النهجين التصوير النسيجية والعيش خلية لتحديد الآليات الكامنة وراء الحركة الوطنية العراقية وظيفتها في تطوير neuroepithelia بما في شبكية العين 9، 11، 12، 13. ومع ذلك، فإن الآليات التي تحكم الحركة الوطنية العراقية في الكبار تجديد شبكية العين لم تدرس في الكثير من التفاصيلسوف XREF "> 6 و 7. التصوير حية على خلية يكون نهجا لا تقدر بثمن للمضي قدما معرفتنا مسارات الإشارات التي تتحكم في الحركة الوطنية العراقية في الكبار تجديد شبكية العين.
حتى وقت قريب، والتصوير الخلية الحية من الحركة الوطنية العراقية في شبكية العين كان محدودا إما الأجنة الزرد حية أو إلى كتكوت الجنينية أو الماوس بعد الولادة إإكسبلنتس الشبكية 9، 10، 11، 12، 14، 15، 16. في حين استخدمت إإكسبلنتس الشبكية من الحيوانات البالغة من مجموعة متنوعة من الأنواع بما في ذلك الجرذان والفئران والزرد لخلية مختلفة النهج البيولوجية 17، 18، 19، 20، تجارب التصوير الخلية الحية باستخدام إإكسبلنتس الشبكية هكتارلقد تم يقتصر على اطلاع فترات من الزمن والتي لم يتم تنفيذها بشكل مستمر على مدى عدة ساعات 21 و 22. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لثقافة الكبار شبكية العين الزرد التي تضررت الضوء على أداء الخلية الحية التصوير تجارب مراقبة الحركة الوطنية العراقية باستخدام متعددة الفوتون المجهري 6. النهج التصوير الخلية الحية هي مفيدة على الطرق المناعية عند التحقيق في آليات السيطرة على الحركة الوطنية العراقية، وديناميات الحركة الوطنية العراقية، على سبيل المثال، قد تتأثر سرعات بدلا من موقع الانقسام، والتي من المحتمل أن لا يتم الكشف عن استخدام مناعية.
في المستقبل، وهذه الطريقة أيضا لديه القدرة على أن يتم تعديل لدراسة العمليات الحيوية الأخرى أثناء تجديد شبكية العين، مثل البلعمة الموت خلايا مستقبلة للضوء عن طريق مولر الدبقية أو سلوك الخلايا الدبقية الصغيرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
دراسات التحقيق في الآليات التي تحكم تجديد الكبار التالفة شبكية العين الزرد الطرق في الغالب تستخدم immunocytochemical 5، 25، 26، 27، 28، 29، 30. تهيئة الظر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نقدر الدعم المقدم من قبل ويليام آرتشر ومرفق نوتردام المتكاملة التصوير. وتوجه بشكر خاص إلى الفنيين في Freimann علوم الحياة لمساعدة مستمرة ورعاية وتربية من الزرد. وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من المعهد الوطني للعيون من المعاهد الوطنية للصحة لDRH (R01-EY018417، R01-EY024519) ومركز بحوث اسماك الزرد، جامعة نوتردام، نوتردام، IN.
Materials
| Dumont forceps size #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps size #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
- Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
- Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O’Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
- Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
- Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
- Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
- Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
- Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
- Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
- Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
- Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
- Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
- Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
- Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
- Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
- Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging–historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
- Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
- Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
- Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
- Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
- Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
- Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
- Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
- Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
- Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
- Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).
