Dissektion MicroCT Scanning og morfometrisk Analyser af Baculum

Summary

Mange biologiske strukturer mangler let definerbare vartegn, hvilket gør det vanskeligt at anvende moderne morfometriske metoder. Her illustrerer vi metoder til at studere muse baculum (en knogle i penis), herunder dissektion og microCT scanning efterfulgt af beregningsmæssige metoder til at definere semi-landmærker, der bruges til at kvantificere størrelse og form variation.

Abstract

Moderne morphometrics giver effektive metoder til at kvantificere variation størrelse og form. Et grundlæggende krav er en liste over koordinater, der definerer vartegn; dog sådanne koordinater skal repræsentere homologe strukturer på tværs prøver. Mens mange biologiske objekter består af let identificerede vartegn for at tilfredsstille antagelsen om homologi, mange mangler sådanne strukturer. En mulig løsning er at matematisk sted semi-vartegn på et objekt, der repræsenterer den samme morfologiske region tværs prøver. Her vil vi illustrere en nylig udviklet rørledning til matematisk definere semi-vartegn fra muse baculum (penis knogle). Vores metoder bør gælde for en bred vifte af genstande.

Introduction

Feltet af morphometrics omfatter en mangfoldighed af metoder til at kvantificere størrelsen og formen af den biologiske form et afgørende skridt i videnskabelig undersøgelse ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Traditionelt den statistiske analyse af størrelse og form begynder ved at identificere vartegn på en biologisk struktur, og derefter måle lineære afstande, vinkler og forhold, som kunne analyseres i en multivariat rammer. Landmark-baserede Geometric Morphometrics er en tilgang, der bevarer den rumlige placering af vartegn, bevare geometriske informationer fra dataindsamling gennem analyser og visualisering ^5. Generaliseret Procrustes Analysis (GPA) kan anvendes til at fjerne variation i placeringen, skala, og rotation af lokaliteter til frembringelse en orientering mellem enheder, minimizes deres kvadrerede forskelle – hvad der er tilbage, er formen forskellighed ^7.

Et vigtigt begreb enhver morfometriske analyse er homologi, eller tanken om, at man pålideligt kan identificere vartegn repræsenterer biologisk meningsfulde og diskrete funktioner, der svarer mellem prøver eller strukturer. For eksempel, menneskelige kranier har homologe processer, foramina, suturer, og kanaler, der kan aktivere morfometriske analyser. Desværre, identifikation af tilsvarende landmærker er vanskeligt på tværs af mange biologiske strukturer, især dem med glatte overflader eller kurver ^{8, 9, 10.}

Vi nærmer os dette problem under brug af beregningsmæssige geometri. Den overordnede arbejdsgang er at generere en tredimensional skanning af det objekt, der kan repræsenteres som en sky af punkter, og derefter rotere og omdanne dette punkt sky således at alle specimens er orienteret om en fælles koordinatsystem. Så vi matematisk definerer semi-vartegn fra specifikke regioner af objektet. Diskrete semi-vartegn placeret på sådanne områder er biologisk vilkårlige ^11. Gennemførelse GPA og efterfølgende statistiske analyser kan producere uønskede artefakter ^{8, 12} fordi vilkårligt placeret vartegn måske ikke biologisk homologe. Derfor tillader vi disse semi-lokaliteter til matematisk "slide". Denne procedure minimerer potentielle forskel mellem strukturer. Som argumenteret andetsteds glidende algoritme, der anvendes her, er hensigtsmæssigt at kvantificere lignende anatomiske regioner mangler let identificeres tilsvarende vartegn ^{3, 6, 8, 10, 11, 12.} Disse metoder har deres limitations ^13, men skal kunne tilpasses til objekter med forskellig størrelse og form.

Her vil vi illustrere, hvordan denne metode blev anvendt i en nylig undersøgelse af musen baculum ^14, en knogle i penis, der er blevet opnået, og mistede flere uafhængige gange i løbet af pattedyr evolution ^15. Vi diskuterer dissektion og fremstilling af en specifik knogle, den baculum (protokol 1), generering af microCT billeder (protokol 2), og omdannelsen af ​​disse billeder til et format, der gør det muligt for alle downstream beregningsmæssige geometri (Protokollerne 3 og 4). Efter disse trin, er hver prøve repræsenteret ved ~ 100K xyz koordinater. Vi går derefter gennem en række transformationer, der effektivt tilpasse alle enheder i en fælles indstilling (Protokol 5), bestemmes semi-vartegn fra afstemt prøver (Protokol 6). Protokoller 1-4 bør svare uanset den analyserede objekt. Protokol 5 og protokol 6 er specifikt designet til en baculum, men det er vores håb, at ved detaljering disse trin, kan efterforskerne forestille ændringer, der ville være relevante for deres objekt af interesse. For eksempel blev modifikationer af disse metoder anvendes til at studere hval bækken knogler og ribbenene ^16.

Protocol

Alle procedurer og personale blev godkendt af University of Southern California Institute for Animal Care og brug Udvalg (IACUC), protokol # 11394. 1. Baculum Dissektion og klargøring Afliv en kønsmoden hanmus via kuldioxid overeksponering, i henhold til protokoller, der er fremsat af den relevante Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). Læg dyret i liggende stilling, og forhale penis ved at anvende pres med tommelfingrene lateralt for forhudskirtlen åbning…

Representative Results

XYZ koordinater for semi-vartegn produceret i protokol 6 kan importeres direkte ind i enhver milepæl-baserede geometriske morphometrics analyse 17. Den beregningsmæssige rørledning ovenfor, er blevet anvendt til at studere muse Bacula 14, samt hval bækken og ribbenene 16. Flere detaljer om den beregningsmæssige definition af semi-vartegn præsenteres her, i et forsøg på at hjælpe forskere visualisere skridt, …

Discussion

De kritiske trin i ovennævnte protokol er 1) dissekere Bacula, 2) at indsamle microCT billeder, 3) at omdanne microCT output til en flad fil af xyz koordinater, 4) segmentering ud hver prøve pointe sky, 5) at omdanne hver prøve til et standardiseret koordinatsystem, og 6), der definerer semi-landmærker. Disse trin let modificeres til at rumme forskellige objekter.

Disse fremgangsmåder kan sandsynligvis anvendes på ethvert objekt, der er i det væsentlige "stang-formet", eller…

Materials

Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland