Dissekering, microCT skanning och Morfometriska Analyser av Penisben

Summary

Många biologiska strukturer saknar lätt definierbara landmärken, vilket gör det svårt att tillämpa moderna morfometriska metoder. Här illustrerar vi metoder för att studera musen Penisben (ett ben i penis), inklusive dissekering och microCT scanning, följt av beräkningsmetoder för att definiera semilandmärken som används för att kvantifiera och storlek variation.

Abstract

Moderna Morfometri erbjuder kraftfulla metoder för att kvantifiera storlek och form variation. Ett grundläggande krav är en lista över koordinater som definierar landmärken; Men sådana koordinater måste representera homologa strukturer över prover. Medan många biologiska objekt består av lätt identifierade landmärken för att tillgodose antagandet av homologi, många saknar sådana strukturer. En möjlig lösning är att matematiskt plats semilandmärken på ett objekt som representerar samma morfologiska region över prover. Här visar vi en nyutvecklad pipeline till matematiskt definiera semilandmärken från mus Penisben (penis ben). Våra metoder bör vara tillämplig på ett brett spektrum av föremål.

Introduction

Området Morfometri omfattar en mångfald av metoder för att kvantifiera storleken och formen av den biologiska formen, ett viktigt steg i vetenskaplig undersökning ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Traditionellt, den statistiska analysen av storlek och form börjar med att identifiera landmärken på en biologisk struktur, och sedan mäta linjära avstånd, vinklar och nyckeltal, som kan analyseras i en multivariat ram. Landmärke baserade geometriska Morfometri är en metod som behåller den rumsliga positionen för landmärken, bevara geometrisk information från datainsamling via analys och visualisering ^5. (GPA) generaliserad Procrustes Analys kan tillämpas för att avlägsna variationer i läge, skala och rotation av landmärken för att producera en inriktning mellan exemplar som Minimizes deras kvadrat skillnader – det som återstår är formen olikhet ^7.

Ett viktigt begrepp i någon morfometrisk analys är homologi, eller tanken att en tillförlitligt kan identifiera landmärken som representerar biologiskt meningsfulla och diskreta funktioner som motsvarar mellan prover eller strukturer. Till exempel, mänskliga skallar har homologa processer, fora, suturer, och kanaler som kan göra det möjligt för morfometriska analyser. Olyckligtvis är det svårt i många biologiska strukturer identifiering av motsvarande landmärken, särskilt de med släta ytor eller kurvor ^{8, 9, 10.}

Vi närmar oss detta problem under användning av beräkningsgeometri. Det generella arbetsflödet är att generera en tredimensionell avsökning av föremål som kan betecknas som ett moln av punkter, och sedan rotera och omvandla det punktmoln så att alla ärpecimens är orienterade på ett gemensamt koordinatsystem. Då kan vi matematiskt definiera semilandmärken från specifika regioner av objektet. Diskreta semilandmärken placeras på sådana områden är biologiskt godtyckliga ^11. Genomföra GPA och efterföljande statistiska analyser kan ge oönskade artefakter ^{8, 12} eftersom godtyckligt placerade landmärken inte kan vara biologiskt homolog. Därför tillåter vi dessa semi-landmärken för att matematiskt "slide". Detta förfarande minimerar potentialskillnaden mellan strukturer. Såsom hävdats annorstädes glid algoritm som används här är lämpligt att kvantifiera liknande anatomiska regioner som saknar lätt identifieras motsvarande landmärken ^{3, 6, 8, 10, 11, 12.} Dessa metoder har sin limitations ^13, men bör vara anpassningsbar till föremål av olika storlek och form.

Här visar vi hur denna metod tillämpades i en nyligen genomförd studie av musen Penisben ^14, ett ben i penis som har fått och förlorade flera oberoende gånger under däggdjurs utveckling ^15. Vi diskuterar dissekering och framställning av en särskild ben, den Penisben (protokoll 1), generering av microCT bilder (protokoll 2), och omvandlingen av dessa bilder till ett format som gör det möjligt för alla nedströms beräkningsgeometri (protokoll 3 och 4). Efter dessa steg, varje prov representeras av ~ 100K xyz-koordinater. Vi går sedan genom en serie av transformationer som effektivt anpassa alla prover till en gemensam orientering (protokoll 5), sedan definiera semilandmärken från inriktade exemplar (protokoll 6). Protokollen 1-4 bör vara densamma oberoende av det objekt som analyseras. Protokoll 5 och protokoll 6 är specifically konstruerad för en Penisben, men det är vår förhoppning att genom att specificera dessa steg, kan utredarna tänka sig modifikationer som skulle vara relevanta för deras objekt av intresse. Till exempel har modifieringar av dessa metoder som används för att studera valar bäckenben och revbenen ^16.

Protocol

Alla förfaranden och personal godkändes av University of Southern California Institute for Animal Care och användning kommittén (IACUC), protokoll # 11394. 1. Penisben Dissection och förberedelse Avliva en könsmogna hanmus via koldioxid överexponering, enligt protokoll som anges av den berörda Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). Låg djuret i ryggläge, och förhala penis genom applicering av tryck med tummen lateralt om preputial öppni…

Representative Results

XYZ koordinater halvlandmärken som produceras i protokoll 6 kan importeras direkt in i någon landmärke baserade geometriska Morfometri analys 17. Beräknings rörledning ovan har tillämpats för att studera mus bacula 14, liksom whale pelvic och revbenen 16. Mer information om beräknings definition av semi-landmärken presenteras här, i ett försök att hjälpa forskare att visualisera åtgärder som kan behöv…

Discussion

De kritiska stegen i ovanstående protokoll är en) dissekera bacula, 2) samla microCT bilder, 3) omvandlar microCT utgång till en platt fil av xyz-koordinater, 4) segmentera ut varje prov s punktmoln, 5) omvandla varje prov till ett standardiserat koordinatsystem, och 6) som definierar halvlandmärken. Dessa steg kan lätt modifieras för att rymma olika objekt.

Dessa metoder kan sannolikt tillämpas på alla objekt som är i huvudsak "stavformad", eller åtminstone inte alltför…

Materials

Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland