Kvalitativ och kvantitativ analys av immun synapsen i det mänskliga systemet använder Imaging flödescytometri
Summary
Här beskriver vi ett komplett arbetsflöde för kvalitativ och kvantitativ analys av immun synapser mellan primära humant T-celler och antigen-presenterande celler. Metoden är baserad på imaging flödescytometri, som tillåter förvärv och utvärdering av flera tusen cell bilder inom en relativt kort tidsperiod.
Abstract
Immun synapsen är området för kommunikation mellan T-celler och antigen-presenterande celler (APC). T-celler polarisera yta receptorer och proteiner mot immun synapsen till försäkrar en stabil bindning och signalera exchange. Klassiskt confocal, Frida eller super-resolution mikroskopi har använts för att studera immun synapsen. Eftersom dessa metoder kräver manuell bild förvärv och tidskrävande kvantifiering, är bildtagning av sällsynta händelser utmanande. Här beskriver vi ett arbetsflöde som möjliggör morfologiska analyser av tiotusentals celler. Immun synapser induceras mellan primära humant T-celler i pan-leukocyt preparat och Staphylococcus aureus enterotoxin B SEB-loaded Raji celler som trupptransportfordon. Bild Förvärvandet utförs med imaging flödescytometri, även kallad i-Flow mikroskopi, som kombinerar funktionerna i en flödescytometer och fluorescens Mikroskop. En komplett Usenets strategi för att identifiera T cell/APC par och analysera immun synapserna tillhandahålls. Som det här arbetsflödet tillåter analys av immun synapser i orenat pan-leukocyt preparat och därmed kräver endast en liten mängd blod (dvs., 1 mL), det kan tillämpas på prover från patienter. Allt kan flera prover vara beredd, mäts och analyseras parallellt.
Introduction
T-celler är större regulatorer av det adaptiva immunsystemet och aktiveras genom antigena peptider som presenteras i samband med större histocompatibility komplex (MHC). Fullständig aktivering av T-celler kräver två signaler, kompetens signalen via den antigen-specifika T-cells receptorn (TCR) / CD3 komplex och costimulatory signalen via tillbehör receptorer. Båda signaler genereras genom direkt samverkan mellan T-celler med antigen-presenterande celler (APC). Mogen trupptransportfordon tillhandahåller kompetens signal för T-cells aktivering via MHC-peptid komplex, och de costimulatory ligander (t.ex., CD80 eller CD86) att säkerställa utvecklingen av T-cells aktivering1. En viktig funktion för costimulation är omordningen av aktin cytoskelettet2,3,4. Den kortikala F-aktin är relativt statisk i vila T-celler. T-cell stimulering genom antigen-bärande trupptransportfordon leder till en djupgående ombildning av aktin cytoskelettet. Aktin dynamics (dvs., snabb aktin polymerisation/depolymerization cirklar) aktivera T-cellerna att skapa krafter som används för transport av proteiner eller organeller, t.ex. Aktin cytoskelettet är dessutom viktig för att utveckla en särskild kontakt zon mellan T-celler och trupptransportfordon, kallas immun synapsen. På grund av vikten av aktin cytoskelettet till immun synapsen, har det blivit nödvändigt att utveckla metoder för att kvantifiera förändringar i aktin cytoskelettet av T celler5,6,7,8 , 9.
Med hjälp av aktin cytoskeletal stöd, är yta receptorer och signalering proteiner åtskilda i supramolekylär aktiveringen kluster (SMACs) inom immun synapsen. Stabiliteten i immun synapsen säkerställs genom bindning av receptorer till F-aktin buntar som ökar elasticiteten i aktin cytoskelettet. Immun synaps bildandet har visat sig vara avgörande för generering av adaptiva immunsvaret. De skadliga effekterna av ett defekt immunförsvar synaps bildas i vivo realiserades först hos patienter som lider från Wiskott Aldrich syndrom (WAS), en sjukdom som aktin polymerisation och, samtidigt, immun synaps bildas störs10 . VAR patienter kan drabbas av eksem, återkommande infektioner, autoimmuna sjukdomar och melanom. Trots detta fynd, är det för närvarande inte känt huruvida immuna synaps bildas skiljer sig i de T-cellerna av friska individer och patienter lider av immundefekter eller autoimmuna sjukdomar.
Fluorescensmikroskopi, inklusive confocal, Frida och super-resolution mikroskopi, användes för att avslöja arkitekturen av immun synaps11,12,13,14. Den höga upplösningen av dessa system och möjlighet att utföra live-cell imaging möjliggör insamling av exakt plats och tid information om aktin cytoskelettet och ytan eller intracellulära proteiner i immun synapsen. Många resultat, dock är baserade på analys av bara några tiotals T-celler. Dessutom måste T-celler renas för dessa typer av fluorescensmikroskopi. Men för många forskningsfrågor är användning av orenat celler i stället för högsta möjliga upplösning av yttersta vikt. Detta är relevant om T-celler från patienter analyseras, sedan av donerat blod är begränsad och det kan vara behovet av att bearbeta många prover parallellt.
Vi etablerade mikroskopiska metoder som möjliggör analys av aktin cytoskelettet i immun synapsen i mänskliga systemet15,16,17. Dessa metoder bygger på imaging flödescytometri, även kallad i-Flow mikroskopi18. Som en hybrid mellan Multispektrala flöde flödescytometri och fluorescence mikroskopi, imaging flödescytometri har sina styrkor i analysera morfologiska parametrar och protein lokalisering i heterogena cellpopulationer, såsom pan-leukocyter från den perifert blod. Vi införde en metod som gör det möjligt för oss att kvantifiera F-aktin i T-cell/APC konjugat av humant T-celler från helblod prover, utan behov av tidskrävande och kostsamma rening steg17. Tekniken presenteras här omfattar hela arbetsflödet, från att få blodprovet att kvantifiering av F-aktin i immun synapsen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arbetsflödet presenteras här möjliggör kvantifiering av immun synapser mellan mänskliga T-celler (ex vivo) och trupptransportfordon. Bland annat användes erytrocyt-lyserat pan-leukocyter som T-cell källor, att göra T-cell reningssteg dispensable. B-cells lymfom cellinje Raji tjänstgjorde som surrogat trupptransportfordon. Detta bär betydande fördelar, eftersom det tillåter jämförelser mellan blodgivare av T-cell sida av immun synapsen. Vidare, autolog DCs finns knappast direkt från perifert blod. Produktio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet finansierades av de Tyskt forskningrådet (DFG) med bidrag nr. SFB-938-M och SA 393/3-4.
Materials
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O’Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
