इस पत्र रक्तस्तम्भन के एक प्रयोगात्मक मॉडल है कि एक साथ प्लेटलेट समारोह और जमावट उपायों का वर्णन है। प्लेटलेट और आतंच प्रतिदीप्ति वास्तविक समय में मापा जाता है, और प्लेटलेट आसंजन दर, जमावट दर, और जमावट की शुरुआत निर्धारित कर रहे हैं। मॉडल आधान के लिए ध्यान केंद्रित में प्रवाह के तहत प्लेटलेट प्रोकोगुलैंट गुण निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
रक्तस्तम्भन के Microfluidic मॉडल hydrodynamic कतरनी की शर्तों के तहत प्लेटलेट समारोह का आकलन है, लेकिन anticoagulants की उपस्थिति में, इस विश्लेषण प्लेटलेट बयान केवल के लिए प्रतिबंधित है। सीए 2 निर्भर जमावट और प्लेटलेट समारोह के बीच के जटिल संबंधों विश्लेषण करने से पहले रक्त की सावधानी से नियंत्रित और पुनर्खटीकरण की आवश्यकता है। हमारे सेटअप एक वाई के आकार का मिश्रण चैनल है, जो रक्त बहने सिर्फ छिड़काव करने से पहले, नमूना ठहराव के बिना तेजी से पुनर्खटीकरण को सक्षम करने के लिए ध्यान केंद्रित सीए 2/2 मिलीग्राम + बफर की आपूर्ति का उपयोग करता है। दोनों जलाशयों के बीच प्रवाह वेग में दस गुना का अंतर कमजोर पड़ने कम करता है। recalcified खून तो एक कोलेजन लेपित विश्लेषण कक्ष में भरकर रखा जाता है, और अंतर लेबलिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग वीडियो दोनों प्लेटलेट और आतंच बयान के वास्तविक समय इमेजिंग परमिट। प्रणाली केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करता है, मानकीकरण की संभावना बढ़ रही है। अपरोक्ष का पुनर्गठनबैंकिंग से प्लेटलेट्स के साथ mbocytopenic रक्त इसके अलावा मॉडल प्लेटलेट ट्रांसफ्यूजन केंद्रित है, इस शोध के क्षेत्र में इसके उपयोग साबित हो। अनुकरणीय डेटा दिखा दिया है कि जमावट शुरू होने और आतंच बयान रैखिक प्लेटलेट एकाग्रता पर निर्भर थे, हमारे मॉडल में प्राथमिक और माध्यमिक रक्तस्तम्भन के बीच के रिश्ते की पुष्टि। 16 छिड़काव मिनट की एक समय सीमा में, संपर्क सक्रियण सामान्य सीए 2 और 2 मिलीग्राम + स्तर के लिए जगह नहीं ले गए थे, पुनर्खटीकरण के बावजूद। जमावट कारक Xiia मकई trypsin अवरोध से हिचकते किया गया था, इस समय सीमा भी रह गया था, काफी गतिशील रेंज में जो प्लेटलेट्स की प्रोकोगुलैंट प्रकृति में परिवर्तन का आकलन किया जा सकता है का संकेत है। कोलेजन के साथ ऊतक कारक के सह-स्थिरीकरण काफी समय जमावट की शुरुआत करने के लिए कम है, लेकिन इसकी दर नहीं। ऊतक कारक और / या संपर्क मार्ग का अध्ययन करने के लिए विकल्प बहुमुखी प्रतिभा और परख की उपयोगिता बढ़ जाती है।
प्राथमिक और माध्यमिक रक्तस्तम्भन मूल रूप से दो अपेक्षाकृत वियोज्य जैव रासायनिक प्रक्रियाओं रूप में की अवधारणा कर रहे थे। प्राथमिक रक्तस्तम्भन, प्लेटलेट्स के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका के साथ धमनी प्रवाह की स्थिति में एक बड़ा योगदान के रूप में देखा गया था, जबकि माध्यमिक रक्तस्तम्भन शिरापरक रक्त प्रवाह के तहत जमावट पर हावी होने की इजाजत दी, प्रोटीज झरना अघुलनशील आतंच के लिए फार्म में देखा गया था। पिछले कुछ दशकों के इस परंपरागत दृष्टिकोण काफी हद तक reshaped है, स्वीकार करते हैं कि प्लेटलेट सक्रियण और जमावट अन्योन्याश्रित हैं और सभी (गैर चरम) hydrodynamic milieus में शारीरिक और रोग रक्तस्तम्भन के दौरान समान रूप से महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं हैं। यह दृश्य क्लिनिक, जहां व्यापक पूरे रक्त जमावट को मापने के लिए तैयार कर लिया assays तेजी से प्रासंगिकता, प्रयोज्यता और उपयोगिता 1 पर कई शेष प्रश्नों के साथ प्रयोग किया जा रहा है, हालांकि करने के लिए अनुवाद किया गया है।
हमने हाल ही में प्लेटलेट की एक कार्यात्मक विश्लेषण प्रकाशित, आधान 2 की इन विट्रो मॉडल में तंतुमय कोलेजन के साथ लेपित microfluidic प्रवाह कक्षों का उपयोग कर लाल रक्त कोशिकाओं, प्लाज्मा, और प्लेटलेट्स की मात्रा सामान्य से युक्त नमूनों के साथ केंद्रित है। इस विधि हेपरिन या Hirudin anticoagulated रक्त, कोई या माध्यमिक रक्तस्तम्भन, जो थ्रोम्बिन पीढ़ी और आयनित कैल्शियम (सीए 2) पर निर्भर है की सीमित भागीदारी जिसका अर्थ का उपयोग करता है। Microfluidic प्रवाह के तहत रक्तस्तम्भन के सभी पहलुओं को शामिल करने के लिए थ्रोम्बिन गठन का समर्थन करने के लिए और इस तरह, हम अब सहित मुक्त सीए 2 ही तकनीकी मंच पर एक पूरक विधि विकसित की है। इस तरह, प्लेटलेट बयान और आतंच गठन का अध्ययन किया जा सकता है, प्लेटलेट ट्रांसफ्यूजन के एक मॉडल में फिर से, प्लेटलेट ध्यान केंद्रित गुणवत्ता का आकलन करने के लिए।
इस विधि में, प्लेटलेट्स और फाइब्रिनोजेन fluorophores कि पूरी तरह से उत्सर्जन स्पेक्ट्रा अलग कर दिया है साथ लेबल रहे हैं। दोहरी रंग, वास्तविक समय वीडियो माइक्रोस्कोपी तब के विश्लेषण परमिटप्राथमिक प्लेटलेट आसंजन, साथ ही जमावट दीक्षा और आतंच बयान। क्योंकि स्थिर रक्त के लिए सीए 2 के अलावा, छिड़काव करने से पहले, अनिवार्य रूप से कंटेनर में संपर्क शुरू की जमावट कारण होगा परख के इस प्रकार में एक महत्वपूर्ण चर, पुनर्खटीकरण है। यह दीक्षा छिड़काव करने से पहले ट्यूबिंग और biochip inlets के clogging के कारण पूर्वाग्रह readout होगा। इसलिए, हमारे विधि में, साइट्रेट रक्त anticoagulated और एक सीए 2 युक्त बफर एक वाई के आकार का प्रवेश कक्ष के ऊपरी पैरों के माध्यम से अलग से पंप हैं। घटकों एक विश्लेषण चैम्बर कोलेजन अकेले या पुनः संयोजक मानव ऊतक कारक (rhTF) के साथ संयोजन के साथ लेपित प्रवेश करने से पहले छिड़काव के दौरान मिलाया जाता है। बफर में अलग पंप के प्रवाह वेग और सीए 2 की एकाग्रता आदत डाल करके, अंतिम रक्त नमूने के एक 10% कमजोर पड़ने जगह लेता है।
इस विस्तारित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम coagula के योगदान को प्रदर्शितtion कारक बारहवीं (FXII) और प्लेटलेट एकाग्रता प्रवाह के तहत मार्ग जमावट दीक्षा संपर्क करने के लिए। हमारे आंकड़े यह भी बताते हैं कि कोलेजन के साथ rhTF कोटिंग से, ऊतक कारक मार्ग समन्वित रूप से मापा जा सकता है।
प्लेटलेट की आधान केंद्रित रोकने या रक्तस्राव को रोकने के thrombocytopenic रोगी के लिए निर्धारित है। इसके नैदानिक प्रभाव हाल ही में तीव्र ल्यूकेमिया 12 के एक ऐतिहासिक समीक्षा में डाला गया था, याद है कि साठ के दशक और सत्तर के दशक में बाल चिकित्सा रोगियों की वृद्धि की जीवित रहने की दर काफी हद तक (प्लेटलेट) ट्रांसफ्यूजन मेडिसिन के क्षेत्र में सुधार के कारण थे। प्लेटलेट केंद्रित भी तीव्र आघात या सर्जरी के दौरान खून बह रहा है स्टेम करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इन परिस्थितियों में, उत्कृष्ट प्रोकोगुलैंट गुण है कि तेजी से रक्तस्तम्भन आरंभ के साथ प्लेटलेट्स पसंद कर रहे हैं, लेकिन प्लेटलेट केंद्रित स्वैच्छिक दाताओं की दान से तैयार कर रहे हैं और, औषधीय दवा के विपरीत, केवल, के द्वारा नहीं (रासायनिक) रचना तैयारी द्वारा मानकीकृत कर रहे हैं। इसलिए, रक्त बैंकिंग के क्षेत्र में कई सवाल अनुत्तरित हैं, इष्टतम दान के तौर तरीकों, भंडारण की स्थिति, और आधान प्रथाओं पर उन सहित। पी एल के क्षेत्र मेंatelet (आधान) जीव विज्ञान, प्रचलन से सेल निकासी पर कई सवाल, रक्तस्तम्भन को चढ़ाया प्लेटलेट्स का योगदान है, या उनके इम्यूनोलॉजी भी अनुत्तरित रह।
प्लेटलेट समारोह के विश्लेषण के लिए कई प्रयोगशाला तकनीक उपलब्ध हैं, लेकिन इनमें से ज्यादातर प्लेटलेट समारोह की एक विलक्षण पहलू को संबोधित, एकत्रीकरण या degranulation 13 की तरह। मोटे तौर पर प्लेटलेट्स और प्लेटलेट केंद्रित का आकलन करने के लिए, रक्तस्तम्भन के व्यापक मॉडल अपरिहार्य हैं, और इन hydrodynamics शामिल करना चाहिए। रक्त rheology सही ढंग से रक्तस्तम्भन 14, 15 या 16 थ्रोम्बोसिस दौरान प्लेटलेट व्यवहार की व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण है, भले ही anticoagulation सीए 2 + रोकता है और / या थ्रोम्बिन साइट्रेट या हेपरिन क्रमश: 2 की उपस्थिति में भाग लेने के लिए। प्रवाह 17 के तहत जमावट और प्लेटलेट समारोह के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के, 18, सामान्य थ्रोम्बिन पीढ़ी की आवश्यकता होती है, और इसलिए, मुक्त सीए 2 के रूप में अच्छी तरह से। क्योंकि उपाय "विरूपण साक्ष्य" या जमावट के अनियंत्रित सक्रियण जितना संभव हो उतना ही लिया जाना चाहिए रोकने के लिए इन शर्तों के तहत रक्तस्तम्भन के अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक स्थापना, जटिल है। कस्टम बनाया हार्डवेयर 19, 20, जो पर्याप्त अंतर-प्रयोगशाला परिवर्तनशीलता का कारण बनता है 5 इसके अलावा, कई विशेष अनुसंधान समूहों का उपयोग करें। इस दृष्टिकोण की विशिष्ट सीमाओं आयताकार वाहिकाओं, गैर गुणवाला प्रवाह प्रोफाइल, और गैर मानव सतह कोटिंग्स 5 का उपयोग कर रहे हैं। परख हम यहाँ वर्णन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करता है और इसलिए मानकीकरण के लिए उपयुक्त हो सकता है।
क्योंकि जमावट झरना प्रतिक्रिया आसानी से एक बार रक्त मानव शरीर के भीतर निहित नहीं है सक्रिय होता है, नियंत्रित पुनर्खटीकरण एक निर्णायक कदम है। टीओ इस लक्ष्य को हासिल, सीए के अलावा 2 + स्थगित किया जा करने की जरूरत है तो बस प्रतिक्रियाशील कोलेजन सतह पर छिड़काव करने से पहले, क्योंकि जब सीए 2 बफर स्थिर रक्त के लिए थोक में आपूर्ति की जाती है, जमावट अनिवार्य रूप से जगह लेता है, अंत में ट्यूबिंग clogging और डेटा biasing व्याख्या (डेटा) नहीं दिखाया। इस समस्या के समाधान के लिए अलग से सीए 2 बफर और रक्त पंप करने, विश्लेषण चैम्बर के लिए अपने रास्ते पर छिड़काव के दौरान संवहनी और वाचाल बलों द्वारा मिश्रण के लिए अनुमति देता है। पूरा मिश्रण मिश्रण और विश्लेषण कक्षों के बीच टयूबिंग की एक 46 सेमी क्षेत्र में हासिल की है। इस्तेमाल किया प्रवाह दर पर छिड़काव के दौरान बड़े पैमाने पर और संवहनी परिवहन 21 के मौलिक कानून (1000 एस -1) पर आधारित मिश्रण करने के लिए यह लंबाई अभिकर्मकों का इष्टतम समय ध्यान केन्द्रित करने के लिए गणना की गई। इस दृष्टिकोण से चलाया और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य साबित कर दिया।
जमावट के संपर्क सक्रियण कभी कभी साधारण के एक विरूपण साक्ष्य के रूप में देखा जाता हैरक्त नमूने और जब थक्के बार की व्याख्या को टाला जा सकता। इसलिए, हम प्रदर्शन किया है कि, अवरोधकों के अभाव में, संपर्क प्रेरित जमावट छिड़काव के 16.7 मिनट (± 3.7 मिनट) में शुरू होता है। सीटीआई की उपस्थिति FXIIa की मध्यस्थता संपर्क सक्रियण को बाधित करने के लिए, जमावट प्रयोग (30 मिनट) का मनमाने ढंग से परिभाषित पाठ्यक्रम के दौरान शुरू नहीं किया गया है। प्रयोग के इस विंडो को पर्याप्त रूप से नमूने है कि समर्थक या antithrombotic हैं विचार करने के लिए लंबा है। हालांकि संपर्क सक्रियण द्वारा जमावट रक्त कृत्रिम सतहों से संपर्क करने का एक अवांछित परिणाम हो सकते हैं, हमारे डेटा प्लेटलेट्स की एक स्पष्ट जैविक खुराक प्रभाव प्रदर्शित करता है। इस ट्रांसफ्यूजन मेडिसिन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, क्योंकि FXII पर हाल के निष्कर्षों, प्लेटलेट polyphosphates 10, phosphatidylserine वितरण 22, और प्लेटलेट microparticles 23 वास्तव में करने के लिए रक्तस्तम्भन, ई एक महत्वपूर्ण योगदान के रूप में संपर्क मार्ग जमावट पुनर्मूल्यांकन हैविशेष रूप से थ्रोम्बोसिस 24 के संदर्भ में। उदाहरण के लिए, रोगियों में प्लेटलेट चढ़ाने की चर उपज या बैंकिंग प्लेटलेट्स की चर phosphatidylserine अभिव्यक्ति इस प्रकार चिकित्सीय प्रभावकारिता में परिवर्तनशीलता के लिए प्रेरित करता है, तो सफल जमावट इन कारकों पर निर्भर करने के लिए दिखाया गया है सकते हैं।
द्वारा कोलेजन, बाह्य जमावट मार्ग, या टीएफ मार्ग के साथ सह-immobilizing lipidated rhTF, कोलेजन पर प्लेटलेट बयान के दौरान सक्रिय है। यह इसकी सबसे व्यापक मोड के लिए परख फैली चोटों कि टीएफ असर कोशिकाओं और ऊतकों के साथ संपर्क में खून लाने के लिए एक मॉडल के रूप में। हमारे डेटा है कि कोलेजन और TF के सह स्थिरीकरण जमावट शुरू होने के पल कम हो जाती है, लेकिन जमावट की दर में परिवर्तन नहीं करता दिखा। ध्यान से, rhTF की राशि की सतह के लिए स्थिर इस मॉडल 25, 26 में एक महत्वपूर्ण चर रहा है और एक निश्चित अध्ययन के भीतर मानकीकृत किया जाना चाहिए। presen मेंसीटीआई के सीई, TF मार्ग विशेष रूप से अध्ययन किया जा सकता है (नहीं दिखाया गया है) क्योंकि संपर्क सक्रियण रोका है।
अंत में, हमारे प्रयोगात्मक सेटअप बैंकिंग प्लेटलेट्स के साथ thrombocytopenic रक्त के पुनर्गठन और कैल्शियम पर निर्भर प्लेटलेट बयान और आतंच गठन के द्वारा रक्तस्तम्भन का एक मॉडल hydrodynamic प्रवाह के तहत द्वारा आधान की एक मॉडल को जोड़ती है। इस परख बैंकिंग प्लेटलेट्स की प्रोकोगुलैंट प्रकृति पर सवालों के जवाब देने में इस्तेमाल किया जाएगा और प्रभाव प्लेटलेट ध्यान केंद्रित तैयार करने की तकनीक इस पर लोगों की है।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध अनुसंधान और बेल्जियम के रेड क्रॉस-फ़्लैंडर्स रक्त सेवा के विकास के लिए फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया। गेन्ट विश्वविद्यालय से साथ अनुबंध संख्या BOF30290744 परियोजना के लिए दी – हम "Bijzonder onderzoeksfond" (विशेष अनुसंधान निधि बीओएफ) द्वारा प्रदान की वित्तीय सहायता को स्वीकार करते हैं।
1 mL Syringe | BD | A00434 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
2 mL Syringe | BD | 307727 | |
Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO |
Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL |
Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
Pipette | Brand | A03429 | |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin |
Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
ZEN2012 software | Zeiss |