מאמר זה מתאר מודל ניסיוני של המוסטאסיס המודד פונקציה וקרישה טסיות זמנית. טסיות קרינת הפיברין נמדדות בזמן אמת, וקצב הידבקות טסיות דם, קרישת שיעור, והתחלה של קרישה נחושה. המודל משמש כדי לקבוע מאפיינים טסיות procoagulant תחת זרם מתרכז עבור עירוי.
מודלי microfluidic של המוסטאסיס להעריך תפקוד טסיות בתנאים של גזירה הידרודינמית, אך בנוכחות של תרופות נגד קרישת דם, ניתוח זה מוגבל בתצהיר טסיות בלבד. הקשר המסובך בין פונקצית הקרישה הטסיות התלויה 2+ Ca דורש recalcification זהיר ומבוקר של דם לפני הניתוח. ההגדרה שלנו משתמשת ערוץ ערבוב בצורת Y, המספק חיץ Ca 2 + / Mg מרוכז 2+ זורם בדם רק לפני זלוף, מה שמאפשר recalcification המהיר ללא קיפאון מדגם. הבדל של פי עשר מהירויות זרימה בין שני מאגרי ממזער דילול. הדם recalcified הוא perfused אז בתא ניתוח מצופה קולגן, וסימון ההפרש מתיר הדמיה בזמן אמת של שניהם בתצהיר טסיות הפיברין באמצעות מיקרוסקופ וידאו הקרינה. המערכת משתמשת רק כלים זמינים מסחרית, להגדיל את הסיכויים של סטנדרטיזציה. כינון של throדם mbocytopenic עם טסיות הפקידה מתרכז יתר דגמים עירוי טסיות, המוכיח את השימוש בו בתחום מחקר זה. נתונים למופת הוכיחו כי התפרצות קרישה בתצהיר הפיברין היו תלויים באופן ליניארי על ריכוז טסיות, המאשר את היחסים בין המוסטאסיס יסודי ותיכון במודל שלנו. בתוך פרק זמן של לפחות 16 זלוף, הפעלת מגע לא התקיימה, למרות recalcification לקדמותו Ca 2+ ורמות Mg 2+. כאשר גורם קרישה XIIa היה עצור על ידי מעכבי טריפסין תירס, מסגרת זמן זו היה אפילו יותר, מה שמעיד על טווח דינמי ניכר בו שינויים באופי procoagulant של טסיות ניתן להעריך. Co-וקיבוע של גורם רקמת קולגן משמעותי את הזמן להופעת קרישה, אבל לא בקצב שלה. האפשרות ללמוד את גורמי רקמה ו / או מסלול הקשר מגדילה את צדדיות שירות של assay.
המוסטאסיס יסודי ותיכון היו להמשיג במקור שני תהליכים ביוכימיים הניתנים להפרדה יחסית. המוסטאסיס ראשי נתפס כתורם מרכזי תנאי זרימה עורקת, עם תפקיד מפתח עבור טסיות, בעוד נתפס המוסטאסיס משני לשלוט קרישה תחת זרימת דם מוריד, המאפשר מפל פרוטאז לגבש הפיברין מסיס. בעשורים האחרונים אשר עצבו השקפה מסורתית זו באופן משמעותי, והודה כי הפעלת טסיות וקרישה תלויות זה בזה הם תהליכים חשובים באותה מידה במהלך המוסטאסיס פיסיולוגי ופתולוגיים בכל (לא קיצוניים) בחוגים הידרודינמית. השקפה זו תורגמה למרפאת, שם מבחנים המציאו כדי למדוד כל-דם קרישה באופן מקיף יותר ויותר בשימוש, אם כי עם הרבה שאלות שנותרו רלוונטית, תחולה וקהילה 1.
פרסמנו לאחרונה אנליזה פונקציונלית של טסיותמרכזת באמצעות תאי זרימה microfluidic מצופה קולגן סיבי במודל במבחנה של עירוי 2, עם דגימות המכילות כמויות רגילות של כדוריות דם אדומות, פלסמה וטסיות דם. שיטה זו משתמשת הפרין או הירודין anticoagulated דם, רומז שום או מעורבות מוגבלת של המוסטאסיס משנית, אשר תלויה הדור תרומבין וסידן מיונן (Ca 2 +). כדי לתמוך היווצרות תרומבין וכך לכלול את כל ההיבטים של המוסטאסיס תחת זרם microfluidic, פיתחנו שיטה משלימה על אותה פלטפורמה טכנית, עכשיו כולל חינם Ca 2 +. בדרך זו, בתצהיר טסיות והיווצרות הפיברין ניתן ללמוד, שוב במודל של עירוי טסיות, כדי להעריך את איכות תרכיז הטסיות.
בשיטה זו, טסיות ו פיברינוגן מסומנים עם fluorophores כי יש להפריד ספקטרום פליטה מלאה. צבע כפול, מיקרוסקופיה וידאו בזמן אמת ואז מתיר ניתוחהידבקות טסיות עיקרית, וכן ייזום קרישה בתצהיר הפיברין. משתנה חשוב בסוג זה של assay הוא recalcification, כי התוספת של Ca 2 + לדם סטטי, לפני זלוף, בהכרח תגרום קרישת קשר ביוזמת בתוך המכל. חניכה זה תהיה להטות את ההודעה עקב סתימת פתחי כניסת צינורות biochip לפני זלוף. לכן, בשיטה שלנו, ציטרט anticoagulated דם וכרית המכילה Ca 2 + נשאבת בנפרד דרך הרגליים העליונות של תא מפרצון בצורת Y. הרכיבים מעורבבים במהלך זלוף לפני הכניסה תא ניתוח מצופה קולגן לבד או בשילוב עם גורמי רקמה אנושי רקומביננטי (rhTF). על ידי התאמת מהירויות הזרימה של משאבות נפרדות ואת הריכוז של Ca 2 + למאגר, דילול 10% מהמדגם דם הסופי מתרחש.
שימוש בפרוטוקול מורחב זה, אנחנו מדגימים את תרומת coagulaXII גורם tion (FXII) וריכוז טסיות לפנות ייזום קרישת מסלול תחת זרם. הנתונים שלנו מראים גם כי על ידי ציפוי rhTF לצד קולגן, מסלול גורמי רקמה ניתן למדוד בו זמנית.
עירוי טסיות מתרכז רושם למטופל thrombocytopenic למנוע או לעצור את הדימום. ההשפעה הקלינית שלה היה מסומן לאחרונה סקירה היסטורית של לוקמיה חריפה 12, ונזכר כי שיעורי ההישרדות מוגבר מטופלים ילדים בשנות השישים והשבעים היו המיוחס בעיקר לשיפורים (טסיות) רפואה עירוי. תרכיזי טסיות משמשים גם כדי לבלום דימום טראומה חריפה או במהלך ניתוח. בתנאים אלה, טסיות עם תכונות procoagulant מצוינות כי במהירות ליזום המוסטאסיס עדיף, אבל מתרכז טסיות ערוכים מתרומות של תורמים מרצון ושלא כמו תרופות פרמקולוגיות, הם טופלו ע"י הכנה בלבד, ולא על ידי רכב (כימי). לכן, כמה שאלות בתחום בנקאות דם הם ללא מענה, כוללים אלה על שיטות תרומה אופטימליות, תנאי אחסון, ושיטות עירוי. בתחום platelet (עירוי) ביולוגיה, שאלות רבות על אישור התא מהמחזור, תרומת טסיות בעירוי כדי המוסטאסיס, או אימונולוגיה שלהם גם נותרו ללא מענה.
טכניקות מעבדה רבות לניתוח תפקוד טסיות זמינות, אבל אלה בעיקר להתמודד עם היבט מיוחד של תפקוד טסיות, כגון איסוף או degranulation 13. כדי רחב להעריך טסיות ותרכיזים טסיות, מודלים מקיפים של המוסטאסיס הם הכרחיים, ועל אלה לכלול הידרודינמיקה. Rheology דם חיוני לפרש התנהגות טסיות כראוי במהלך המוסטאסיס 14, 15 או פקקת 16, גם אם קרישה מונע Ca 2 + ו / או תרומבין להשתתף במעמד ציטראט או הפרין, בהתאמה 2. כדי לחקור את יחסי הגומלין בין קרישה ותפקוד טסיות תחת זרם 17, 18, דור תרומבין רגיל נדרש, ולכן, Ca חינם 2 + גם כן. הגדרת הניסוי ללימוד המוסטאסיס בתנאים אלה מורכבת, היות אמצעים למניעה "חפץ" או הפעלה לא מבוקרת של קרישה צריכה לקחת כמה שיותר. יתר על כן, הרבה קבוצות מחקר מיוחדות להשתמש בחומרת מחוייט 19, 20, הגורם השתנות היתר ומעבדה משמעותיות 5. מגבלות טיפוסיות של גישה זו הן את השימוש של כלי מלבני, פרופילי זרימה בלתי pulsatile, וציפויי משטח שאינו אדם 5. את assay המתואר כאן משתמש בכלים זמינים מסחרי ולכן עשוי להיות מתאים סטנדרטיזציה.
בגלל תגובת מפל הקרישה מופעלת בקלות ברגע דם ולא בתוך גוף האדם, נשלטה recalcification היא צעד מכריע. To להשיג זאת, תוספת של Ca 2 + צריכה להידחות עד ממש לפני זלוף על פני קולגן תגובתי, כי כאשר מאגר Ca 2+ מסופק בכמויות גדולות לדם סטטי, באופן בלתי נמנעת הקרישה מתרחשת, בסופו של דבר סתימת צינורות הטיית נתונים פרשנות (מידע לא מוצג). הפתרון לבעיה זו הוא להגביר את חיץ Ca 2 + והדם בנפרד, המאפשר ערבוב ידי כוחות הסעה ו מתרחבים במהלך זלוף בדרכה אל חדר הניתוח. ערבוב מלא מושגת קטע 46 ס"מ של צינורות בין תאי ערבוב וניתוח. אורך זו חושבה בפעם להתעכב אופטימלי של ריאגנטים לערבב מבוסס על חוקי היסוד של המוני ותחבורה הסעה 21 במהלך זלוף בשיעור הזרימה משמש (1,000 s -1). גישה זו הוכיחה לשליטה לשחזור.
הפעלה של קרישה לתקשר לפעמים נתפסה כמוצר של פשוטדגימת דם כדי להימנע כאשר לפרש פעמי קרישה. לכן, הראינו כי, בהעדר מעכבי קרישה נגרם קשר מתחילה ב 16.7 דקות (± 3.7 דקות) של זלוף. בנוכחות CTI לעכב הפעלת מגע בתיווך FXIIa, קרישה ולא הוחל במהלך מוגדר באופן שרירותי של הניסוי (30 דק '). חלון של ניסויים זה ארוך מספיק כדי להבחין דגימות כי הם בעד או אנטי-תרומבוטי. למרות קרישה על ידי הפעלת קשר יכולה להיות תוצאה לא רצויה של דם למחלקת משטחים מלאכותיים, הנתונים שלנו ומוכיחות השפעה במינון ביולוגית ברורה של טסיות. זה יכול להיות חשוב עבור רפואת עירוי, כי ממצאים אחרונים על FXII, טסיות polyphosphates 10, הפצת phosphatidylserine 22, ו microparticles טסיות 23 יש המשוערך למעשה קרישת מסלול מגע בתור תורם חשוב המוסטאסיס, דוארבמיוחד בהקשר של פקק 24. למשל, התשואה המשתנה של עירויי טסיות בחולים או ביטוי phosphatidylserine משתנה של טסיות פקידה ניתן אפוא לגרום השתנות יעילות טיפולית אם מוצגת קרישה מוצלחת תלוי בגורמים אלה.
על ידי שיתוף משתק lipidated rhTF עם קולגן, תוואי הקרישה החיצוני, או מסלול TF, מופעל במהלך בתצהיר טסיות על קולגן. זה מרחיב את assay למצב המקיף ביותר שלה, כמודל פציעות המביאים דם במגע עם תאים TF נושאות ורקמות. הנתונים שלנו מראים כי שיתוף וקיבוע של קולגן TF מקטין את רגע הופעת קרישה אך אינו משנה את קצב קרישה. מן הראוי לציין כי כמות rhTF משותקת על פני השטח היא משתנה חשוב במודל זה 25, 26 ויש טופל בתוך מחקר נתון. ב presence של CTI, מסלול TF ניתן ללמוד באופן בלעדי (לא מוצג) כי הפעלת מגע נמנעת.
לסיכום, הגדרת הניסוי שלנו משלבת מודל של עירוי על ידי כינון מחדש של דם thrombocytopenic עם טסיות פקידה ודגם של המוסטאסיס ידי בתצהיר טסיות סידן תלוי היווצרות הפיברין תחת זרם הידרודינמית. assay זה ישמש כדי לענות על שאלות על טבע procoagulant של טסיות פקידה ואת הטכניקות הכנה להתרכז השפעות טסיות יש על זה.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי הקרן למחקר ופיתוח של שירות דם חוצת פלנדריה האדומה הבלגי. אנו מכירים תמיכה פיננסית הניתנת על ידי "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF – קרן מחקר מיוחדת) מאונ' גנט שהוענקה הפרויקט עם BOF30290744 מספר החוזה.
1 mL Syringe | BD | A00434 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
2 mL Syringe | BD | 307727 | |
Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO |
Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL |
Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
Pipette | Brand | A03429 | |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin |
Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
ZEN2012 software | Zeiss |