Bu makale aynı zamanda trombosit fonksiyonu ve pıhtılaşmayı ölçen hemostaz deneysel model tanımlamaktadır. Trombosit ve fibrin floresans gerçek zamanlı olarak ölçülür ve platelet yapışma oranı, bir pıhtılaşma hızının, pıhtılaşma başlangıcı belirlenir. Model transfüzyonu için konsantreleri akışı altında trombosit prokoagülan özelliklerini belirlemek için kullanılır.
hemostaz mikroakışkan modelleri hidrodinamik kesme koşulları altında trombosit fonksiyonu değerlendirmek ancak antikoagülan mevcudiyetinde, bu analiz, trombosit birikimi sadece sınırlıdır. Ca 2 + bağımlı koagülasyon ve trombosit fonksiyonu arasındaki karmaşık ilişki analizden önce kan dikkatli ve kontrollü n yeniden gerektirir. Bizim kurulum Örnek staz olmaksızın hızlı n yeniden etkinleştirme hemen önce perfüzyon kan akışı konsantre Ca 2 + / Mg2 + tampon malzemeleri, Y-şeklinde karıştırma kanalı kullanır. Her iki rezervuar arasındaki akış hızında bir on kat bir fark seyreltme en aza indirir. recalcified kan daha sonra kollajen kaplı analiz odasına perfüze edilir ve ayırıcı markalama flüoresans görüntü mikroskopi kullanılarak hem trombosit ve fibrin depolanmasının gerçek zamanlı görüntüleme izin verir. Sistem standardizasyon şansı artan, sadece piyasada mevcut araçları kullanır. bir uçtan bir uca bir SulandırmaÖbekli gelen trombositler ile mbocytopenic kan bu araştırma alanında kullanımını kanıtlayan, modeller ayrıca trombosit transfüzyonu yoğunlaşmaktadır. Örnek veri pıhtılaşma başlangıcı ve fibrin birikimi bizim modelinde primer ve sekonder hemostaz arasındaki ilişkiyi doğrulayan, trombosit konsantrasyonu doğrusal bağımlı olduğunu göstermiştir. 16 perfüzyon dakikalık bir zaman dilimi içinde, iletişim aktivasyonu, normal Ca 2+ ve Mg 2+ seviyelere n yeniden rağmen, yer almadı. pıhtılaşma faktörü XIIa mısır tripsin inhibitörü ile inhibe edilmiştir, bu zaman çerçevesi trombositlerin prokoagülan gelen değişiklikler tespit edilebilir olan önemli bir dinamik aralık ile daha uzun idi. kollajen doku faktörünün Eş-immobilizasyon önemli ölçüde hızını koagülasyon başlama zamanı azalır, ancak. doku faktörü ve / veya kontak yolu incelemek için seçenek testinin çok yönlülük ve yarar artırır.
Primer ve sekonder hemostaz aslında iki nispeten ayrılabilir biyokimyasal süreçler olarak kavramsallaştırma edildi. İkincil hemostaz proteaz kaskad çözünmeyen fibrin oluşturmak için izin, venöz kan akışı altında pıhtılaşmasını hakim görüldü ise birincil hemostaz, trombositlerin için önemli bir role sahip, arter akım koşullarında önemli bir katkı olarak görülüyordu. Son birkaç on yıl bu trombosit aktivasyonu ve koagülasyon birbirine bağımlı ve tüm (aşırı olmayan) hidrodinamik çevrelerde fizyolojik ve patolojik hemostaz sırasında eşit derecede önemli süreçlerdir kabul, esasen bu geleneksel görünümünü yeniden şekillendirmiştir. Bu görüş kapsamlı tam kan pıhtılaşmasını ölçmek için tasarlanmış tahliller giderek alaka, uygulanabilirliği ve yarar 1 birçok kalan sorular olsa kullanılmakta olan kliniğe, tercüme edilmiştir.
Biz son zamanlarda trombosit fonksiyonel bir analiz yayınladıKırmızı kan hücreleri, plazma ve trombosit normal miktarlarını ihtiva eden numuneler ile transfüzyon 2 bir in vitro modelinde fibriler kolajen ile kaplanmış mikro-akışkan akış odası kullanılarak yoğunlaşmaktadır. Bu yöntem, heparin ya da hirudin veya hiç trombin üretimi ve iyonize kalsiyum (Ca 2+) bağlıdır sekonder hemostaz, sınırlı katılımı ima, kan antikoagüle kullanır. Mikroakışkan akış altında hemostaz tüm yönleriyle dahil böylece trombin oluşumunu desteklemek ve için, biz şimdi Ca 2 + da dahil olmak üzere, aynı teknik platform üzerinde tamamlayıcı bir yöntem geliştirdi. Bu şekilde, trombosit birikimi ve fibrin oluşumu trombosit konsantresi kalitesini değerlendirmek için, tekrar trombosit transfüzyon modelinde, ele alınabilir.
Bu yöntemde, trombositler ve fibrinojen tam emisyon spektrumları ayrılmış olduğu florofor ile etiketlenir. Çift renkli, gerçek zamanlı video mikroskobu sonra analiz edilmesini sağlarBirincil platelet yapışma, hem de koagülasyon başlatma ve fibrin oluşumu. Statik kana Ca 2 eklenmesi, perfüzyon önce, kaçınılmaz olarak bir kap içinde temas başlatılan pıhtılaşma neden olur, çünkü Bu tür testlerde önemli bir değişken, n yeniden olup. Bu inisiyasyon nedeniyle önce perfüzyon tüp ve biochip girişlerinin tıkanması için önyargı okuma olacak. Bu nedenle, yöntem, sitrat kan pıhtılaşması önlenmiş ve Ca + 2 içeren tampon, Y-şeklinde, giriş bölmesinin üst bacak boyunca ayrı pompalanır. bileşenleri kollajen tek başına ya da rekombinan insan dokusu faktörü (rhTF) ile kombinasyon halinde ile kaplı bir analiz odasına girmeden önce perfüzyon sırasında karıştırılır. Tampon içinde, ayrı pompalarının akış hızları ve Ca2 + konsantrasyonu uyarlayarak, son kan numunesinin% 10 seyrelti gerçekleşir.
Bu genişletilmiş protokolü kullanarak, Coagula katkısını göstermektediryon faktörü XII (FXII) ve trombosit konsantrasyonu akış altında yolu koagülasyon başlangıcını başvurun. Verilerimiz kolajen birlikte rhTF kaplayarak, doku faktörü yolu eşzamanlı olarak ölçülebilir olduğunu göstermektedir.
Trombosit transfüzyonu önlemek veya kanamayı durdurmak için trombositopenik hasta için reçete konsantreleri. Onun klinik etkisi yakın zamanda altmışlı ve yetmişli yıllarda pediatrik hastalarda artmış sağkalım oranları (trombosit) transfüzyonu tıp gelişmeler büyük ölçüde atfedilebilecek olduğunu hatırlatarak, akut lösemi 12 tarihi bir inceleme vurgulandı. Trombosit konsantreleri akut travma veya ameliyat sırasında kanama kök kullanılır. Bu koşullarda, hızla hemostaz başlatmak mükemmel prokoagülan özelliklere sahip trombositler tercih edilir, ancak trombosit konsantreleri farmakolojik ilaç aksine, değil, yalnızca (kimyasal) kompozisyonu ile hazırlık tarafından standardize edilir, gönüllü donörlerin bağışlardan hazırlanır ve. Bu nedenle, kan bankacılığı alanında birçok soru optimum bağış modaliteleri, saklama koşulları ve transfüzyon uygulamaları konusunda da dahil olmak üzere, cevapsız bulunmaktadır. pl alanındaatelet (transfüzyon) biyoloji, dolaşımdan hücre temizlenmesi ile ilgili birçok soru, hemostaz transfüzyonu trombositlerin katkısı, ya da immünoloji da cevapsız kalmaktadır.
Trombosit fonksiyon analizi için çok sayıda laboratuar teknikleri mevcuttur, ancak bunlar çoğunlukla toplama veya degranülasyon 13 gibi, trombosit fonksiyonunun tekil yönünü ele almaktadır. geniş trombosit ve trombosit konsantreleri değerlendirmek için, hemostaz kapsamlı modelleri vazgeçilmez ve bu hidrodinamik içermelidir. Kan reoloji antikoagülan Ca önler + 2 ve / veya trombin sitrat veya heparin sırasıyla 2 varlığında katılma bile, doğru hemostaz 14, 15 ya da tromboz 16 trombosit davranışı yorumlamak için çok önemlidir. Akış 17 altında koagülasyon ve trombosit fonksiyonu arasındaki etkileşimi incelemek için, 18, normal bir trombin üretimi serbest Ca hem de 2+, dolayısıyla gerekli olup. tedbirler "objeyi" ya da pıhtılaşmanın kontrol dışı aktivasyonu mümkün olduğunca alınmalıdır bilmek için, bu koşullar altında hemostaz çalışmak için deney düzeneği karmaşıktır. Ayrıca, birçok uzman araştırma grupları kullanmak ısmarlama donanım 19, 20, önemli laboratuvarlar arası değişkenliği neden 5. Bu yaklaşımın tipik sınırlamalar dikdörtgen kaplar, non-pulsatil akım profilleri, ve insan olmayan yüzey kaplamaları 5 kullanımı vardır. Biz burada açıklamak tahlil piyasada mevcut araçları kullanır ve bu nedenle standardizasyon için uygun olabilir.
Kan insan vücudu içinde yer almayan bir kez koagülasyon kaskadı Reaksiyon kolayca aktive olduğu için, kontrol edilen n yeniden çok önemli bir adımdır. To Bu elde ertelenmesi gereken Ca2 + eklenmesi sadece reaktif kolajen yüzeyine perfüzyon önce, Ca 2 + tamponu sabit kan toplu olarak sağlandığında olduğu için, pıhtılaştırma kaçınılmaz sonunda boru tıkanma ve veri ağırlık verme yer alır, yorumlanması (veriler gösterilmemiştir). Bu sorunun çözümü analiz odasına yolunda perfüzyon sırasında konvektif ve pasif güçleri tarafından karıştırma için izin ayrı ayrı Ca 2 + tampon ve kan pompalamak olduğunu. Tam Karıştırma ve analiz bölmeler arasında bir boru 46 cm segmenti elde edilir. Bu uzunluk reaktif optimal bekleme süresi hesaplandı kullanılan akış hızında perfüzyon sırasında kütle ve konvektif taşıma 21 temel yasaları (1000 s -1) dayalı mix için. Bu yaklaşım, kontrol edilebilir ve tekrarlanabilir olduğunu kanıtladı.
koagülasyon İletişim aktivasyonu bazen basit bir eser olarak görülüyorpıhtılaşma kez yorumlanırken, kan örnekleme ve kaçınılması gereken. Bu nedenle, inhibitör yokluğunda, temas kaynaklı koagülasyon perfüzyon 16.7 dakika (± 3.7 dakika) ile başlar, bu gösterdi. FXIIa aracılı iletişim aktivasyonunu inhibe CTI varlığında, pıhtılaşma deneyi (30 dakika) olarak tanımlanmış sırasında başlatılır. deney bu pencere pro- ya da anti-trombotik olan örnekleri ayırt etmek yeterli uzunluktadır. iletişim aktivasyonu pıhtılaşma kan yapay yüzeylerin temas istenmeyen sonucu olabilir olsa da, bizim veri trombositlerin net bir biyolojik doz etkisini göstermektedir. FXII üzerinde yeni bulgular, trombosit, 10 polifosfatlar fosfatidilserin dağılımı 22 ve trombosit mikropartikülleri 23 aslında hemostaz, e önemli bir katkı olarak temas yolu pıhtılaşmasını yeniden değerlenmiş çünkü bu, transfüzyon tıbbı önemli olabilirÖzel olarak tromboz 24 bağlamında. Başarılı koagülasyon bu faktörlere bağlı gösterilir Örneğin, hastalarda trombosit transfüzyon değişken getiri veya banked trombosit değişken fosfatidilserin ifadesi böylece terapötik etkinlik değişkenliği neden olabilir.
Tarafından kollajen, dışsal pıhtılaşma rota veya TF yolağı ile lipidlenmiş rhTF co-immobilize, kollajen trombosit depolanması sırasında aktive edilir. Bu TF-taşıyan hücreler ve doku ile temas halinde kan getirmek yaralanmalar için bir model olarak, en kapsamlı moduna tahlili uzanır. Verilerimiz, kollajen ve TF birlikte immobilizasyon koagülasyon başlangıç anını azaltır, ancak pıhtılaşmanın oranını değiştirmediğini gösterir. Dikkat çekici bir yüzeye immobilize rhTF miktarı bu model 25, 26 önemli bir değişkendir ve belirli bir çalışma içinde standardize edilmelidir. presen içindetemas aktivasyonu önlenir, çünkü CTI CE TF yolu özel olarak incelenebilir (gösterilmemiştir).
Sonuç olarak, bizim deney düzeneği banked trombositler ile trombositopenik kan sulandırma ve hidrodinamik akış altında kalsiyum bağımlı trombosit birikimi ve fibrin oluşumu ile hemostaz bir model tarafından transfüzyon bir model birleştirir. Bu tahlil banked trombositlerin prokoagülan doğası üzerine soruları yanıtlamak için kullanılan ve etkileri trombosit konsantresi hazırlama teknikleri bu konuda sahip olacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma Araştırma ve Belçikalı Kızıl Haç-Flanders Kan Hizmet Geliştirme Vakfı tarafından desteklenmiştir. sözleşme numarası BOF30290744 ile projeye verilen Ghent Üniversitesi'nden – Biz "bijzonder onderzoeksfond" (özel araştırma fonu BOF) tarafından sağlanan mali destek için minnettarım.
1 mL Syringe | BD | A00434 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
2 mL Syringe | BD | 307727 | |
Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO |
Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL |
Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
Pipette | Brand | A03429 | |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin |
Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
ZEN2012 software | Zeiss |