Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for hurtig behandling av post-mortem diffuse iboende pontin glioma prøver for etablering av pasientavledet cellekulturmodeller eller direkte karakterisering av tumorceller og microenvironmental.
Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) er en barndom hjernetumor som bærer et universelt dødelig prognose. Fordi kirurgisk fjerning er ikke en levedyktig behandlingsstrategi og biopsi er ikke rutinemessig utført, er tilgjengeligheten av pasientprøver for forskning begrenset. Derfor innsats for å studere denne sykdommen har blitt utfordret av en sparsomt med trofaste sykdomsmodeller. For å møte dette behovet, beskriver vi her en protokoll for hurtig behandling av post-mortem obduksjons vevsprøver for å frembringe holdbare pasient-avledet cellekulturmodeller som kan brukes i in vitro prøver eller in vivo ortotopiske xenograft eksperimenter. Disse modellene kan brukes til å screene for potensielle narkotika mål og å studere fundamentale pathobiological prosesser innen DIPG. Denne protokollen kan videre utvides til å analysere og isolere tumor og microenvironmental celler ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS), som gjør det mulig for påfølgende analyse av genet expression, protein uttrykk, eller epigenetiske modifikasjoner av DNA på bulk celle eller celle-nivå. Endelig kan denne protokollen også være tilpasset til å generere pasient-avledet kulturer for andre sentralnervesystemet tumorer.
DIPG er en aggressiv sentralnervesystemet malignitet som oppstår i ventral pons, vanligvis i midten av barndommen 1, 2. Til tross for flere tiår med kliniske studier, er nåværende behandling begrenset til strålebehandling, noe som gir midlertidig forbedring eller stabilisering av symptomer og bare forlenger median overlevelse med et gjennomsnitt på 3 måneder. Selv med strålebehandling, er median total overlevelse bare 9 måneder med 90% av barn som dør av sykdommen innen 2 år etter første diagnosen. På grunn av den infiltrerende arten av tumoren og de kritiske funksjoner av hjernestammen, er kirurgisk fjerning ikke mulig. Videre, i USA, skaffe kirurgiske biopsier for DIPG har historisk sett ikke utført tre, som histopatologiske analyser har ingen nåværende rolle i å veilede klinisk behandling og diagnose kan vanligvis gjøres ved neuroimaging alene. Således tilgjengeligheten av tumorvev feller studier er begrenset, noe som begrenser arbeidet med å gjennomføre forskning på legemiddelkandidat molekyler og den underliggende tumorbiologi. Spesielt, har forbedringer i bildediagnostiske og stereotaktisk teknikk tillot utvikling av sikre biopsier av DIPG i de senere år 4, som, når kombinert med fremskritt innen molekylær biologi, har revolusjonert vår forståelse av sykdommen. Foreløpig flere kliniske studier med upfront biopsi og molekylær profilering av DIPG for individualisering behandlingsplaner er pågående (NCT01182350, NCT02274987) 5.
DIPG og andre barne høy klasse hjernesvulst representerer forskjellige sykdommer fra sine voksne glioblastom kolleger 6, 7, og dermed trofaste eksperimentelle modeller av DIPG er nødvendig for å forstå dens unike patofysiologi og finne effektive terapeutiske strategier. I de siste årene fokusert innsats for å få DIPG svulst tproblem for forskning ved obduksjon eller mindre vanlig, biopsi har revolusjonert vår forståelse av og evne til å studere DIPG. Genomsekvensering innsats avslørte en tilbakevendende mutasjon i H3 histon, familie 3A (H3F3A) og histon klynge 1, H3b (HIST1H3B), som representerer den første eksempel på human sykdom forårsaket av mutasjoner i histon-kodende proteiner 8, 9, 10, 11 . Videre er en undergruppe av DIPGs uttrykker mutasjoner i ACVR1 genet, som ikke tidligere er blitt rapportert i kreft, men er identiske med mutasjoner som finnes i det medfødte barndommen utviklingsforstyrrelse fibrodysplasia ossificans progressiva 8, 9, 10, 11. I tillegg er de første pasient avledet DIPG cellekulturer og orthotopic xenograft moDet er nå etablert dels 1, 2, 12, 13, 14, samt musemodeller etableres gjennom direkte xenotransplantasjon av tumorceller i immundefekte mus for å generere serie xenotransplantater 3, 14, 15. Innledende narkotika screening innsats ved hjelp av disse pasient avledet modeller har identifisert lovende nye midler for klinisk oversettelse 4, 14 og har lagt grunnlaget for minst én klinisk studie (NCT02717455).
Disse første skritt mot fremgang er bare begynnelsen, og en rekke pasient avledet vevsprøver og kultur modeller vil være nødvendig å definere undergrupper av sykdommen og utvikle den mest effektive terapeutiske strategier. genetisk motorEred musemodeller av DIPG vil også legge til rette for studier som tar sikte på å fremme våre grunnleggende forståelse av sykdommen. Arbeidet er gjort for å generere genetiske modeller for DIPG vil bli hjulpet av de grunn genomiske studier omtalt ovenfor, men i dag et begrenset antall alternativer er tilgjengelige. En slik modell, som genererer histologisk lignende høyverdige hjernestammen hjernesvulst, bruker viral RCAS / tv-et system for å drive PDGF-B overekspresjon og Ink4a-ARF tap i nestin-positive celler i bakre skallegrop av neonatal mus 5, 16. En annen metode involverer recapitulating flere store DIPG-assosierte mutasjoner (histon H3.3 K27M mutasjon, p53 tap og PDGFRA aktivering) i neurale forløperceller avledet fra humane embryonale stamceller, noe som er tilstrekkelig til å gjøre disse cellene tumorigene 6, 7, 17. Kombinasjonen av genetiske metoder og pasient derived modellene vil gjøre det mulig preklinisk testing og videre utvikling av effektive behandlinger.
For å møte utfordringene til DIPG forskning beskrevet ovenfor, ble denne raske obduksjon protokoll utviklet for å generere pasient avledet cellekulturer for undersøkelse 8, 9, 10, 11, 12, 14. Protokollen er ment å beskytte levedyktigheten av vevet og maksimere sannsynligheten for å generere varige kulturer til tross for utfordringene knyttet til utvidede obduksjons intervaller og transporttid. Når ble generert, kan disse DIPG kulturene bli brukt i etterfølgende in vitro-manipuleringer og in vivo eksperimenter xenograft, slik at for evaluering av potensielle terapeutiske molekyler på pasient-avledede celler.
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for hurtig behandling av post-mortem tumorvev donasjoner for å utvikle pasient-avledet cellekulturer, som kan brukes i en rekke in vitro eller in vivo-forsøk. På grunn av naturen av å jobbe med obduksjonsprøver, opprettholde prøven levedyktighet utgjør en betydelig utfordring. Flere grunner, blant annet post-mortem intervall for å obduksjon eller den tid som kreves for transportering av vev, bør minimaliseres så mye som mulig, men ofte er vanskelig å kontrollere. I vår erfaring, en post mortem intervall på mindre enn 6 – 8 timer (fra tidspunktet for dødsfallet til den tiden at vevet er plassert i iskald skipsfart og transport media) har gitt den beste muligheten for å etablere en varig cellekultur. Det er best å motta deretter vevet i laboratoriet i løpet av 24 timer, og behandler det for kulturen umiddelbart etter mottak.
Siden plasseringen av disse sjeldne tilfeller varierer mye, ogkvaliteten på vevet henting steg sterkt påvirker sjansen for å lykkes, kan logistikken av å utføre obduksjon være utfordrende. I mange tilfeller, for å oppnå den 6-8 timers rammen, er det ikke mulig å gjennomføre vev avling på et akademisk senter. I stedet har en vev utvinning tjenesten på vakt for å gjenopprette svulstvev i begravelsen hjemme under en IRB-godkjent protokoll er ofte mer hensiktsmessig for vev utvinning. Innhenting av informert samtykke i forkant av døden er anbefalt og letter logistikkplanlegging. Forbereder selvstendige obduksjons kits med klare og grundige instruksjoner og sterile forsyninger for vev gjenfinning (hansker, gardiner, skalp) anbefales sterkt. I tillegg etablere klare punkter for kommunikasjon blant de etterforsker, patolog, og begravelsesbyrået er kritisk. For eksempel bør etterforsker diskutere protokollen med patologen før obduksjonen og markere vanlige feil. Disse feilene inkluderer mikroBIAL forurensning (vanligvis gjær) i løpet av vev henting, unnlatelse av å sende gjennom natten / rask levering og unnlatelse av å sende prøven på tilstrekkelig våt is i en thermoinsulated container. Til slutt anbefaler vi å bruke en dør-til-dør budtjeneste for forsendelse av prøven for å redusere transporttiden.
Forsiktighet bør også tas i løpet av vev dissosiasjon å bevare celle levedyktighet. For eksempel, bruk av media designet bevare nervevev helse for transport (Hibernate-A supplert med antibiotika / antimycotic) vil øke sjansen for å generere en vellykket kultur. Det er også viktig å holde prøven ved en kald temperatur i hele protokollen ved alltid å overføre prøvene på is. Innsamling av både mekaniske og enzymatiske dissosiasjon fraksjoner sammen med minimere triturering kan forbedre protokoll suksess, som begge trinnene traumatisk til celler. I vår erfaring, mens de fleste vellykkede kulturer vokse ut av begge fraksjonerVi har hatt tilfeller hvor bare en av de to preparatene er etablert en holdbar kultur, eventuelt gjenspeiler den skjøre natur av disse prøvene. En annen traumatisk skritt i protokollen er finmaling; en strategi som kan redusere graden av finmaling nødvendig er at prøvene er grundig hakket helt i begynnelsen av preparatet. Andre eksempler på aspekter ved protokoll utviklet for å forbedre prøven levedyktighet inkluderer legge buffere (f.eks HEPES) i hele protokollen, noe som er spesielt viktig ved enzymatisk dissosiasjon.
En mulig modifikasjon av denne protokollen for ytterligere å øke cellelevedyktigheten er fjerning av ACK røde blodcellelysetrinn. Men i dette tilfellet, er det ofte er da nødvendig å utføre en ACK-lyseringstrinn i løpet av den første uke i kultur for å fjerne røde blodceller. Et annet aspekt av denne protokoll som kan modifiseres er elimineringen av myelin og cellerester ved hjelp av en sukrose Polyetyleny gradient. Nærmere bestemt, andre strategier som har blitt rapportert å forbedre celle-levedyktighet mikrogliale celler er også mulig ved dette trinn, slik som en diskontinuerlig Percoll tetthetsgradient 18 eller magnetiske myelin fjerning kuler.
Til slutt, varighet mellom innledende vev dissosiasjon og utseendet neurosfærer varierer mellom prøvene og kan ta alt fra en uke til en måned eller mer. Ettersom de innledende kulturene inneholder typisk en betydelig grad av døde celler og cellerester, det kan være vanskelig å fastslå om levedyktige celler forblir; kulturen bør opprettholdes i minst 4 – 8 uker (figur 2). En strategi for å isolere voksende celler fra de gjenværende rusk er presentert her (dvs. omvendt filtrering cellegrupper og re-plating i frisk media). Avgjørelsen om man skal fortsette å opprettholde en kultur er i siste instans en sak-til-sak avgjørelse basert på forhold rundt the obduksjon (f.eks en lengre post mortem intervall, problemer under vev transport), vevet dissosiasjon (for eksempel overdreven blod eller rusk), og hvordan prøven vises i kultur. Når en kultur er etablert, bør identiteten valideres ved DNA fingerprinting hjelp av korte tandem gjentagelse analyse eller en lignende metode, å sammenligne kulturen til en prøve av den opprinnelige tumor beholdt for dette formål. Vi anbefaler rutinemessig validering kulturer ved DNA fingerprinting for å sikre at ingen forurensning av andre kulturer har oppstått, for eksempel hver 3. – 6 måneder.
Den generasjonen av disse pasient avledet DIPG kulturer representerer et viktig skritt i den vellykkede utviklingen av effektive behandlinger. Utvidelsen av de tilgjengelige pasient avledet DIPG kulturer og xenograft modeller vil være avgjørende for å identifisere de mest effektive terapeutiske strategier og til slutt overvinne denne ødeleggende sykdommen.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke for støtten fra McKenna Claire Foundation, Nasjonalt institutt for nevrologiske lidelser og hjerneslag (ninds K08NS070926 og R01NS092597), Department of Defense (NF140075), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM RB4-06093 og RN3-06510), Alex Lemonade Stand Foundation, The Cure Starter nå Foundation og DIPG Collaborative, Lyla Nsouli Foundation, Unravel Pediatric Cancer, oppvekst hjernesvulst Foundation, Matthew Larson Foundation, V Foundation, Godfrey Family Fund i Memory of Fiona Penelope, den Wayland Villars DIPG Foundation, Dylan Jewett Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, og Jennifer Kranz Memorial Funds, N8 Foundation, Virginia og DK Ludwig fond for kreftforskning, Child Health Research Institute ved Stanford Anne T. og Robert M. Bass Velsignet fakultet stipend i Pediatric kreft og blodsykdommer.
Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
HBSS | Corning | 21-022-CV | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
GlutaMAX-I (100X) | Gibco | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco | 11140-050 | |
Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Razor blades | VWR | 55411-050 | |
100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
Sterile drapes | 3M | 2037 | |
Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |