عزل المغناطيسي السريع والمكرر CD11b من الابتدائية الخلايا الدبقية الصغيرة مع الطهارة تعزيز وطلاقة
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الجراء الماوس بعد الولادة (يوم 1) لسنة المختبر التجريب. هذه الطريقة المرتجلة من العزلة يولد على حد سواء عالية الغلة والنقاء، وهي ميزة كبيرة على الطرق البديلة التي تسمح التجريب نطاق واسع لأغراض توضيح البيولوجيا دبقية.
Abstract
الخلايا الدبقية الصغيرة هي المستجيبين الأولية للإهانات الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير غير معروف حول دورهم في تنظيم neuroinflammation. الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا أرومية متوسطة التي تعمل على نحو مماثل لالضامة في المسح الإجهاد التهابات. كما تم تمديد الكلاسيكية (M1 من نوع) والبديل (M2 من نوع) التنشيط الضامة إلى الخلايا الدبقية الصغيرة في محاولة لفهم أفضل للتفاعل الكامنة وراء هذه الظواهر لها في ظروف neuroinflammatory مثل الشلل الرعاش والزهايمر، وأمراض هنتنغتون. في التجارب في المختبر الاستفادة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية العروض نتائج سريعة وموثوق بها التي يمكن أن تمتد إلى البيئة في الجسم الحي. ورغم أن هذا هو ميزة واضحة على الجسم الحي في التجريب، وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة مع تحقيق عوائد كافية من النقاء الأمثل قد يشكل تحديا. الطرق الشائعة المستخدمة حاليا إما يعانون من الانتعاش، وانخفاض النقاء، أو كليهما. هنا، نحن ماركاonstrate صقل للCD11b طريقة الفصل المغناطيسي خالية من العمود الذي يحقق الانتعاش خلية عالية وتعزيز نقاء في نصف مقدار الوقت. ونحن نقترح هذا الأسلوب الأمثل نموذجا مفيدا للغاية من العزلة دبقية الأولية لأغراض دراسة neuroinflammation والتنكس العصبي.
Introduction
الخلايا الدبقية الصغيرة هي الضامة المقيمين MYB مستقلة من أصل أرومية متوسطة، والتي تفرق من ج طقم + / CD45- erythromyeloid الأسلاف في الجزر الدم من الكيس المحي 1 و 2. مرة واحدة الخلايا الدبقية الصغيرة الجنينية قد استعمرت الجهاز العصبي المركزي (CNS)، والانتقال من أميبية إلى شكل متشعب 3. وتصنف هذه الخلايا الدبقية الصغيرة الكبار كما surveillant منذ تشعباتها ديناميكية التحقيق لحمة الدماغ صحية للإهانات المحتملة 4. على الرغم من أن الخلايا الدبقية الصغيرة تساهم فقط إلى ما يقرب من 10٪ من سكان الخلية CNS، وقدرتهم على البلاط بين بعضها البعض وتضمن المسح القصوى من لحمة 4 و 5. أنماط الخطر المصاحب الجزيئية (DAMPs)، مثل α-synuclein 6 و 7 و 8 اميلويد β، أو عathogen المصاحب أنماط الجزيئية (PAMPs) مثل lipopolysaccharide في (LPS) 9، وتفعيل كلاسيكي الخلايا الدبقية الصغيرة لتعزيز استجابة التهابية تتميز العودة إلى الدولة أميبية نشطة وإنتاج أكسيد النيتريك، عامل نخر الورم α (TNFα)، انترلوكين 1β (IL-1β)، IL-6، IL-12، وchemokine CC عزر يجند 2 9 و 10 و 11. في ظروف neuroinflammatory مثل مرض باركنسون، والتي تراكمت لديها الإمراض α-synuclein، يتم إنشاء دورة الاعصاب من موت الخلايا العصبية الدوبامين، التي تطلق أكثر مجمعة α-synuclein، زيادة تعزيز تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة الكلاسيكية من 7. على غرار الضامة الطرفية، قد يكون الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا القدرة على تفعيل بدلا من ذلك في وجود السيتوكينات المضادة للالتهابات IL-4 و IL-10، مما يتيح لهم قويةالاتحاد العالمي للتعليم لتعزيز إصلاح العصبي وتخفيف التهاب 2، 11. وبصرف النظر عن الأدوار المناعية في الجهاز العصبي المركزي، وقد وصفت الخلايا الدبقية الصغيرة كمنظمات حيوية من الدوائر العصبية التي كتبها تشذيب نقاط الاشتباك العصبي خلال التنمية. على سبيل المثال، الفئران Cx3cr1- KO لها الخلايا الدبقية الصغيرة أقل كثافة وخفض التقليم متشابك، الأمر الذي يؤدي إلى فرط العمود الفقري شجيري، نقاط الاشتباك العصبي غير ناضجة، وأنماط الكهربية من متخلف CNS 12. فهم هذه التعقيدات الفسيولوجية والأدوار الوظيفية متنوعة من الخلايا الدبقية الصغيرة في التوازن للجهاز العصبي المركزي أمر بالغ الأهمية للبحث عن علاجات تستهدف الاضطرابات العصبية.
في مجال علم المناعة العصبية، في التجارب المختبرية ومرغوب فيه للغاية بسبب إمكانية أكبر للدراسات الميكانيكية، وانخفاض تكاليف الصيانة، ولكونها أقل زمنيا وكثيفة العمالة. Furthermoإعادة، والقدرة على عزل السكان الخلية أمر بالغ الأهمية لتحديد وظائف هذه الخلايا المستهدفة تحت الشروط المنصوص عليها. توجد طرق عديدة العزلة دبقية صغيرة، لكنها محدودة بسبب قدرتها على الحصول على أعداد كبيرة نسبيا ونقاء للتجريب واسعة 13 و 14 و 15. على سبيل المثال، مجموعة من 11B التمايز (CD11b) هي علامة السطح مشتركة من وحيدات، الضامة، والخلايا الدبقية الصغيرة 16. من خلال استغلال CD11b، وصفت طريقة الفصل المغناطيسي أولا باعتباره النهج القائم على العمود الذي أسفرت ~ 99.5٪ النقاء و~ 1.6 × 10 6 الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ حديثي الولادة 17. وضعت مختبرنا مؤخرا CD11b طريقة الفصل المغناطيسي خالية من الأعمدة 15، والتي أجرينا في أنبوب البوليسترين عن طريق وضع علامات CD11b مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مترافق إلى فيكوإيريترين (PE). A SECONDA bispecificراي أجسام مضادة لPE والمجمعات ديكستران مع PE. مرة واحدة ملزمة، يتم إدخال الجزيئات المغناطيسية المغلفة ديكستران، الذي ربط نهاية ديكستران من مجمع الأضداد. وأخيرا، يتم وضع أنبوب البوليسترين في جذب للعزلة دبقية صغيرة. تضاعف هذا النهج العائد إلى ~ 3.2 × 10 6 الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ حديثي الولادة ولكن على حساب الحد النقاء إلى ~ 97٪.
هنا، علينا أن نظهر خالية من الأعمدة CD11b بروتوكول الفصل المغناطيسي السريع والمكرر (الشكل 1). لا تزال هذه الطريقة تحسن ممكنا كما لدينا وسيلة خالية من الأعمدة الأصلي لأن سعر الطقم الفصل المغناطيسي CD11b هو نفسه. يتم تقليل وقت الانتهاء منه في النصف، والتي يمكن أن تكون حاسمة لتعظيم بقاء الخلية والعائد. تجدر الإشارة إلى أن نقاء تحقق من هذا الأسلوب الأمثل هو ~> 99٪، تحسنا ملحوظا على مدى نقاء يتحقق من طريقة خالية من الأعمدة الأصلية التي وضعتها مختبرنا 15. الأهم من ذلك، CD11b-PEلا يستخدم، مما يلغي الحاجة لاحتضان بعيدا عن الضوء والسماح باستخدام القناة الحمراء للفحص المجهري مضان. وأخيرا، كما هو الحال في طريقة CD11b الأصلي، ويتم الحصول على جزء نجمي الخلايا من ارتفاع العائد والنقاء مع هذا الأسلوب محسن. الخلايا النجمية هي الخلايا الدبقية الأكثر عددا في الجهاز العصبي المركزي، مما يؤدي إلى فكرة أن مهامهم التماثل الساكن لا غنى عنها في ما يتعلق الفيزيولوجيا المرضية 18. هذه الخلايا الدبقية يلعب دورا في الوظائف الفسيولوجية المختلفة مثل تشكيل حاجز الدم في الدماغ، وتقديم الدعم المغذيات، والحفاظ على ناقل عصبي التوازن، وتشكيل الندوب الدبقية ردا على إصابة، العصبية والتعلم والذاكرة، وneuroinflammation، لاثبات قدراتهم التحقيق في الدبقية علم الأحياء 19. وقد تم التأكد من التشكل وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر، غرب النشاف، الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR-QRT)، Gفحص النتريت ريس، وLuminex متعدد خلوى الفحص. صقل المنصوص عليها في هذا البروتوكول يقدم زيادة الثقة المتعلقة نقاء دبقية أو نجمي الخلايا، وتطبيق أوسع المجهر مضان مع توافر القناة الحمراء، ويوفر الوقت، والتي تعتبر مهمة لفي المختبر التجريب.
Protocol
Representative Results
Discussion
أقدم أساليب العزلة دبقية لها المستردة المحدودة التي ليست مناسبة للبروتين مختلف يحلل طخة غربية وRNA يحلل من قبل QRT-PCR. تمسك التفاضلية وأساليب trypsinization خفيفة نهجان المشتركة مع عوائد منخفضة دبقية 13 و 14 و 15. لديه نهج CD11b الق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) المنح: NS088206 وES026892. وW. يوجين ولليندا لويد هبوا الرئيس على AGK وعمداء الأستاذية إلى AK واعترف أيضا.
Materials
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
References
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
- Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson’s disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
- Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson’s disease. 신경과학. 302, 89-102 (2015).
- Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).
- Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson’s Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
- Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson’s Disease: Foe and ally?. 신경과학. 302, 59-73 (2015).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma, ., J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
- Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
- Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
- Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson’s disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
- Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).
