原代小胶质的快速和精细的CD11b电磁隔离带增强的纯度和多功能性
Summary
这里，我们提出用于体外实验的协议来隔离来自出生后小鼠幼仔的小胶质细胞（1天）。此简易分离方法产生了高收率和纯度，在替代方法一个优点显著允许阐明小胶质生物学的目的范围广泛的实验。
Abstract
小胶质细胞是主要的反应，以中枢神经系统损伤;然而，还有许多关于他们在调节神经炎症的作用尚不清楚。小胶质细胞是功能类似于在巨噬细胞炎性测量应力中胚层细胞。经典的（M1型）和替代（M2型）的巨噬细胞的激活也已经扩展到小神经胶质细胞中是为了更好地理解下面的相互作用这些表型具有在神经炎性病症，例如帕金森氏，阿尔茨海默氏症，和亨廷顿氏病。 体外实验利用初级小胶质细胞提供了可以扩展到体内环境的快速和可靠的结果。虽然这是在体内实验具有明显的优势，隔离的小胶质细胞而实现最佳的纯净，足够的产量一直是个挑战。目前使用的常用方法无论是从回收率低，纯度低，或两者受苦。在此，我们高程模型onstrate该实现中的时间量的一半高的细胞回收和提高的纯度的无柱的CD11b磁分离方法的改进。我们建议这种方法优化为主的小胶质细胞分离为研究神经炎症和神经退行性病变的目的非常有用的模型。
Introduction
小胶质细胞是中胚层起源的MYB-亚独立定居巨噬细胞，其选自c-kit + / CD45 -分化erythromyeloid在卵黄囊1，2的血岛祖细胞。一旦胚胎的小胶质细胞已定植的中枢神经系统（CNS），它们从一个变形虫过渡到网状形式3。因为它们的动态后果探测潜在的侮辱4良性脑实质这些成人小胶质细胞被列为监视者。虽然小胶质细胞只向CNS细胞群的约10％，其以瓦能力彼此之间确保了实质4,5的最大扫描。危险相关的分子模式（DAMP的），如α突触核蛋白6,7和淀粉样蛋白β8，或对athogen相关分子模式（PAMP），如脂多糖（LPS）9，经典激活的小胶质细胞，以促进其特征在于，回复到变形虫活动状态，产生一氧化氮，肿瘤坏死因子α（TNFα），白介素1β的炎症反应（IL-1β），IL-6，IL-12，和趋化因子CC基序配体2 9，10，11。在神经炎性病症，例如帕金森氏病，其中致病α突触核蛋白积累了，神经变性周期从多巴胺能神经元，其中释放出更多的聚集α突触核蛋白的死亡创建的，进一步促进小胶质细胞7的经典活化。类似于周巨噬细胞，小神经胶质细胞还可具有在抗炎细胞因子IL-4和IL-10的存在下交替地激活的能力，给他们的有效的促进神经修复和衰减炎症2，11 IAL。除了在中枢神经系统的免疫作用，小胶质细胞已被开发过程中修剪突触描述为神经回路的重要调节器。例如，Cx3cr1- KO小鼠具有较少致密的小胶质细胞和减少突触修剪，这导致树突棘，未成熟的突触，并不发达CNS 12的电图案的过剩。在CNS中的稳态了解这些生理复杂性和小胶质细胞的各种功能性作用是对寻求治疗剂靶向神经变性疾病的关键。
在神经免疫学领域， 在体外实验是因为机理研究更大的可行性非常可取的，较低的维护成本，并为是少时间和劳动密集。 Furthermo再，以分离细胞群的能力是在规定条件下以描绘那些靶细胞的功能性是至关重要的。无数小胶质细胞的分离方法存在，但它们可通过它们，以获得相对高的数量和纯度为广泛的实验13，14，15的能力的限制。例如，分化11b的簇（细胞CD11b）是单核细胞，巨噬细胞，小胶质细胞和16的共同的表面标志物。通过利用细胞CD11b，磁分离的方法最初被描述为每新生儿脑17产生了基于列的办法〜99.5％的纯度，和〜1.6×10 6的小胶质细胞。我们实验室最近开发了一种无柱的CD11b磁分离方法15，我们在聚苯乙烯管通过用缀合藻红蛋白（PE）的单克隆抗体标记的CD11b进行。一种双特异性第二ARY抗体到PE和与PE葡聚糖复合物。一旦结合，葡聚糖包被的磁性颗粒被引入，其结合所述抗体复合物的葡聚糖端。最后，聚苯乙烯管放置在小神经胶质细胞隔离的磁铁。这种方法增加了一倍的产率每〜新生儿脑，但在减少纯度〜97％的成本3.2×10 6的小胶质细胞。
在本文中，我们展示了一个快速和精制无柱的CD11b磁选协议（ 图1）。由于CD11b的磁分离试剂盒的价格是一样的这种改进的方法仍然是我们原来的无柱的方法是可行的。完成时间减半，这可以最大限度地提高细胞的存活和产量至关重要的减少。值得注意的是，从这个优化的方法实现纯度〜> 99％，比从我们的实验室15开发的原始无柱方法实现的纯度显着改善。最重要的是，细胞CD11b-PE没有被利用，从而无需从光孵育远，并允许荧光显微镜使用红色通道的。最后，如在原来的CD11b的方法，用这种改进的方法获得高产率和高纯度的星形细胞级分。星形胶质细胞是中枢神经系统中最大量的胶质细胞，导致的想法，他们的自我平衡的功能有关的病理生理学18不可缺少的。这些胶质细胞在不同的生理功能，如形成血 – 脑屏障，提供营养支持，维持神经递质的动态平衡，响应损伤神经保护作用形成胶质疤痕，学习和记忆，和神经炎症，体现他们的调查潜在的胶质中发挥作用生物学19。形态与小胶质细胞和星形胶质细胞的功能都通过激光共聚焦显微镜，免疫印迹，实时定量聚合酶链反应（定量RT-PCR），G被确定里斯亚硝酸盐测定中，和Luminex多重细胞因子测定。由这个协议所提供的精细化提供更高的置信度涉及小胶质星形细胞或纯度，与红色信道的可用性荧光显微镜的更广泛的应用，并节省了时间，所有这些都是在体外实验重要。
Protocol
Representative Results
Discussion
旧版小胶质细胞的分离方法具有有限的回收率关于各种蛋白通过Western印迹分析和RNA通过qRT-PCR分析是不恰当的。差分的粘附性和温和的胰蛋白酶消化的方法是具有低的小神经胶质收率13，14，15两种常用的方法。基于列的CD11b的方法也有低回收率，但实现了比差的粘附性和温和的胰蛋白酶消化<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NS088206和ES026892：这项工作是由健康（NIH）全国学院资助。在尤金和琳达·劳埃德主席赋予给AGK和院长教授以AK也被确认。
Materials
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
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