Snelle en Geraffineerde CD11b magnetische Isolatie van Primary Microglia met verbeterde zuiverheid en veelzijdigheid
Summary
Hier presenteren we een protocol microglia van postnatale muizen pups isolaat (dag 1) voor in vitro experimenten. Deze geïmproviseerde winmethode genereert zowel hoge opbrengst en zuiverheid, een significant voordeel boven alternatieve werkwijzen die breed experimenten met het oog op toelichting van microgliale biologie maakt.
Abstract
Microglia zijn de primaire responders centrale zenuwstelsel beledigingen; Echter, er nog veel onbekend over hun rol in het reguleren van inflammatoire processen. Microglia zijn mesodermale cellen die op dezelfde functie om macrofagen te onderzoeken inflammatoire stress. De klassieke (M1-type) en alternatieve (M2-type) activering van macrofagen zijn ook uitgebreid tot microglia in een poging om beter inzicht in de onderliggende wisselwerking deze fenotypen hebben neuroinflammatoire aandoeningen zoals Parkinson, Alzheimer en Huntington ziekten. In vitro experimenten met behulp van primaire microglia biedt snelle en betrouwbare resultaten die kunnen worden uitgebreid tot de in vivo omgeving. Hoewel dit een duidelijk voordeel in vivo experimenten, isoleren microglia terwijl toereikende opbrengst optimale zuiverheid is een uitdaging. Gemeenschappelijke methoden die momenteel in gebruik ofwel lijden hebben van lage herstel, lage zuiverheid, of beide. Hierin we demonstrate een verfijning van de kolomvrije CD11b magnetische scheidingswerkwijze die een hoge terugwinning van cellen en verhoogde zuiverheid helft van de tijd bereikt. Wij stellen dit geoptimaliseerd methode als een zeer bruikbaar model van de primaire microglia isolatie ten behoeve van het bestuderen van neuro-inflammatie en neurodegeneratie.
Introduction
Microglia zijn Myb onafhankelijk macrofagen van mesodermale oorsprong, die onderscheiden van c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitorcellen in het bloed eilandjes van de dooierzak 1, 2. Zodra embryologische microglia het centrale zenuwstelsel (CNS) hebben gekoloniseerd, die overstappen van een amoeboid een vertakte vorm 3. Deze volwassen microglia worden geclassificeerd als surveillant omdat hun dynamische vertakkingen sonde het gezond hersenweefsel voor potentiële beledigingen 4. Hoewel microglia enkel bij tot ongeveer 10% van het CZS celpopulatie, gaf aan tegels onderling verzekert maximale aftasten van het parenchym 4, 5. Risico-geassocieerde moleculaire patronen (gedempt), zoals α-synucleïne 6, 7 en amyloid-β 8 of pathogen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) zoals lipopolysaccharide (LPS) 9, klassiek activeren microglia een ontstekingsreactie gekenmerkt door terugkeer naar de amoeboid actieve toestand en de productie van stikstofoxide, tumornecrosefactor-α (TNFa), interleukine 1β bevorderen (IL-1β), IL-6, IL-12, en de chemokine CC motief ligand 2 9, 10, 11. In neuro aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, waarbij pathogene α-synucleïne heeft verzameld, wordt een neurodegeneratieve cyclus gecreëerd uit de dood van dopaminergische neuronen, die meer geaggregeerd α-synucleïne vrij, verdere bevordering klassieke activering van microglia 7. Soortgelijke perifere macrofagen, microglia kunnen ook de mogelijkheid om afwisselend te activeren in aanwezigheid van de anti-inflammatoire cytokines IL-4 en IL-10, waardoor ze de krachtigeial van het bevorderen van neurale reparatie en verzachtende ontsteking 2, 11. Naast hun immunologische rol in het CZS, zijn microglia beschreven als essentieel regulatoren van neuronale circuits door snoeien synapsen tijdens de ontwikkeling. Bijvoorbeeld Cx3cr1- KO muizen hebben minder dicht microglia en verminderde pruning, wat leidt tot een overvloed aan dendritische onvolgroeide synapsen en elektrofysiologische patronen een onderontwikkelde CNS 12. Inzicht in deze complexe fysiologische en diverse functionele rol van microglia in de homeostase van het CZS is cruciaal voor het onderzoek naar therapeutica gericht neurodegeneratieve aandoeningen.
Op het gebied van Neuroimmunology, in vitro experimenten zijn zeer gewenst vanwege de grotere haalbaarheid van mechanistische studies, lagere onderhoudskosten en minder tijds- en arbeidsintensief. Furthermoopnieuw, het vermogen om celpopulaties te isoleren is van cruciaal belang om de functionaliteit van deze doelcellen af te bakenen onder de voorgeschreven omstandigheden. Tal van microglia isolatie methoden bestaan, maar ze zijn beperkt door hun vermogen om relatief grote aantallen en zuiverheid te verkrijgen voor breed georiënteerde experimenten 13, 14, 15. Bijvoorbeeld, een cluster van differentiatie 11b (CD11b) is een gemeenschappelijk oppervlak marker monocyten, macrofagen en microglia 16. Door gebruik CD11b werd een werkwijze voor magnetische scheiding eerst beschreven als een kolom benadering die leverde ~ 99,5% zuiverheid ~ 1,6 x 10 6 microglia per hersenschade 17. Ons laboratorium onlangs een kolomvrije CD11b magnetische scheidingswerkwijze 15, die we in een polystyreen buis uitgevoerd door tagging CD11b met een monoklonaal antilichaam geconjugeerd aan fycoerythrine (PE). Een bispecifiek secondary antilichaam voor PE en dextran complexen met PE. Eenmaal gebonden worden met dextran beklede magnetische deeltjes geïntroduceerd, die binden aan het dextran einde van de antilichaamcomplex. Ten slotte wordt de polystyreen buis in een magneet voor microgliale isolatie. Deze benadering verdubbelde de opbrengst ~ 3,2 x 10 6 microglia per neonatale hersenen, maar ten koste van het verminderen zuiverheid ~ 97%.
Hierin tonen we een snelle en geraffineerde kolomvrije CD11b magnetische scheidingsprotocol (figuur 1). Deze verbeterde werkwijze blijft uitvoerbaar als onze oorspronkelijke kolomvrije methode, omdat de prijs van het CD11b magnetische scheidingskit hetzelfde. De doorlooptijd is gehalveerd, die cruciaal zijn voor het maximaliseren van celoverleving en opbrengst kan worden. Met name de bereikte zuiverheid van deze geoptimaliseerde methode ~> 99%, een duidelijke verbetering ten opzichte van de bereikte zuiverheid van de oorspronkelijke kolomvrije ontwikkeld door ons laboratorium 15. Belangrijker nog, CD 11-PEwordt niet gebruikt, waardoor de noodzaak om weg te incuberen tegen licht en die het gebruik van het rode kanaal voor fluorescentiemicroscopie. Tenslotte, zoals in het oorspronkelijke CD11b werkwijze kan een fractie van astrocytische hoge opbrengst en zuiverheid wordt verkregen met deze verbeterde werkwijze. Astrocyten de meest talrijke gliacellen in het centrale zenuwstelsel, wat leidt tot het idee dat hun homeostatic functies zijn onmisbaar in relatie tot de pathofysiologie 18. Deze gliale cellen spelen een rol bij verschillende fysiologische functies zoals het vormen van de bloed-hersenbarrière, die voedingsstoffen ondersteunen, handhaven neurotransmitter homeostase, vormen gliale litteken in reactie op verwonding, neurobescherming, leren en geheugen, en zenuwontsteking, als voorbeeld hun onderzoeks- potentieel gliale 19 biologie. Morfologie en functionaliteit van microglia en astrocyten zijn vastgesteld via confocale microscopie, Western blotting, kwantitatieve Real-time PCR (qRT-PCR), GRiess nitriet assay en de Luminex multiplex cytokine assay. De verfijning die door dit protocol biedt meer vertrouwen met betrekking tot de microglia of astrocytaire zuiverheid, ruimere toepassing van fluorescentiemicroscopie met de beschikbaarheid van het rode kanaal, en bespaart tijd, die van belang zijn voor in vitro experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oudere microgliale isolatiemethoden hebben beperkte terugwinning die niet geschikt zijn voor verschillende eiwitten geanalyseerd door Western blot en RNA werden geanalyseerd aan qRT-PCR. De differentiële hechting en milde trypsinisatie methoden zijn twee algemene benaderingen lage opbrengsten microgliale 13, 14, 15. De kolommen gebaseerde benadering CD11b ook geringe hoeveelheid, maar realiseert grotere zuiverheid dan differen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) Subsidies: NS088206 en ES026892. De W. Eugene en Linda Lloyd leerstoel aan AGK en Deans hoogleraar aan AK worden hierbij ook erkend.
Materials
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
References
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
- Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson’s disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
- Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson’s disease. 신경과학. 302, 89-102 (2015).
- Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).
- Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson’s Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
- Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson’s Disease: Foe and ally?. 신경과학. 302, 59-73 (2015).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma, ., J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
- Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
- Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
- Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson’s disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
- Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).
