Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll Mikroglia aus postnataler Maus Welpen (Tag 1) für in – vitro – Experimente zu isolieren. Diese improvisierte Isolierungsmethode erzeugt sowohl hohe Ausbeute und Reinheit, einen bedeutenden Vorteil gegenüber alternativen Methoden, die für die Zwecke der Erläuterung Mikroglia biology breites Spektrum Experimente ermöglicht.
Abstract
Mikroglia sind die primären Responder auf Zentralnervensystem Beschimpfungen; bleibt jedoch viel Unbekanntes über ihre Rolle bei der Regulierung der neuroinflammation. Mikroglia sind mesodermalen Zellen, die in der Vermessung entzündliche Stress ähnlich wie Makrophagen funktionieren. Der klassische (M1-Typ) und alternativer (M2-Typ) Aktivierungen von Makrophagen haben auch Mikroglia in dem Bemühen, erweitern das darunter liegende Zusammenspiel dieser Phänotypen haben in neuroinflammatorische Bedingungen wie Parkinson, Alzheimer und Huntington-Erkrankungen besser zu verstehen. In – vitro – Experimente unter Verwendung von primären Mikroglia bieten schnelle und zuverlässige Ergebnisse , die auf die in – vivo – Umgebung erweitert werden können. Obwohl dies ein klarer Vorteil gegenüber in vivo Experimenten Mikroglia zu isolieren , während eine adäquate Ausbeuten optimale Reinheit zu erreichen eine Herausforderung gewesen. Gängige Methoden zur Zeit in Gebrauch entweder leiden unter niedriger Erholung, geringe Reinheit, oder beides. Wir berichten hier über DMonstrate eine Verfeinerung der säulenfreien CD11b magnetischen Trennverfahren, die eine hohe Zellgewinnung und eine verbesserte Reinheit in der Hälfte der Menge an Zeit erreicht. Wir schlagen vor, diese optimierte Methode als sehr nützliches Modell der primären Mikroglia-Isolierung für die Zwecke der neuroinflammation und Neurodegeneration zu studieren.
Introduction
Mikroglia sind Myb unabhängige Makrophagen mesodermalen Ursprungs, die von c-kit + / CD45- unterscheiden erythromyeloid Vorläufern in den Blutinseln des Dottersacks 1, 2. Sobald embryologischen Mikroglia das zentrale Nervensystem (ZNS) kolonisiert haben, Übergangs- sie von einer zu einer verästelten amoeboid Form 3. Diese Erwachsenen Mikroglia als surveillant klassifiziert , da ihre dynamische Verzweigungen das gesunde Hirnparenchyms für mögliche Beleidigungen Sonde 4. Obwohl nur Mikroglia auf etwa 10% der Bevölkerung CNS Zelle beitragen, ihre Fähigkeit , untereinander zu tile gewährleistet maximaler Abtastung des Parenchyms 4, 5. Gefahren-associated molecular patterns (DAMPS), wie beispielsweise α-Synuclein 6, 7 und Amyloid-β 8 oder pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) , wie beispielsweise Lipopolysaccharid (LPS) 9, aktiviert klassisch Mikroglia eine entzündliche Reaktion durch Reversion zum amoeboid aktiven Zustand und die Produktion von Stickstoffmonoxid, Tumornekrosefaktor-α (TNF & agr;), Interleukin 1β gekennzeichnet Förderung (IL-1β), IL-6, IL-12 und das Chemokin CC motif Ligand 2 9, 10, 11. In neuroinflammatorischen Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit, in denen pathogene α-Synuclein angesammelt hat, ist eine neurodegenerative Zyklus von dem Tod von dopaminergen Neuronen geschaffen, die mehr aggregierte α-Synuclein lösen, weitere klassische Aktivierung der Mikroglia 7 zu fördern. Ähnlich wie bei peripheren Makrophagen, Mikroglia kann auch die Fähigkeit hat, alternativ in der Gegenwart des anti-inflammatorischen Zytokine IL-4 und IL-10 aktiviert, so dass ihnen die potenten gebenial neuronaler Reparatur zu fördern und zu dämpfen Entzündungen 2, 11. Abgesehen von ihren immunologischen Funktionen im ZNS, Mikroglia wurden als vital Regulator der neuronalen Schaltkreise beschrieben von Synapsen während der Entwicklung Beschneiden. Zum Beispiel haben Cx3cr1- KO – Mäuse weniger dichte Mikroglia und reduziert synaptic pruning, was zu einer Überfülle von dendritischen Dornen führt, unreife Synapsen, und die elektrophysiologischen Muster eines unterentwickelten CNS 12. diese physiologische Komplexität und die vielfältigen funktionalen Rollen des Mikroglia in der Homöostase des ZNS zu verstehen, ist für Therapeutika Targeting neurodegenerativen Erkrankungen zur Suche kritisch.
Im Bereich der Neuroimmunologie, sind in – vitro – Experimente sehr wünschenswert , wegen der größeren Machbarkeit für mechanistische Studien, die geringer Wartungskosten, und für weniger zeit- und arbeitsintensiv. FurthermoRe, ist die Fähigkeit, Zellpopulationen zu isolieren, kritisch, um die Funktionalität dieser Zielzellen unter vorgeschriebenen Bedingungen zu beschreiben. Zahlreiche Mikroglia – Isolierungsmethoden existieren, aber sie sind durch ihre Fähigkeit begrenzt relativ hohe Zahlen und Reinheit für breites Experimentieren 13, 14, 15 zu erhalten. Zum Beispiel ist ein Cluster der Differenzierung 11b (CD11b) ein gemeinsamer Oberflächenmarker von Monozyten, Makrophagen und Mikroglia 16. Durch Ausnutzen CD11b wurde ein Verfahren zur magnetischen Trennung zunächst als säulenbasierte Ansatz beschrieben , dass ~ 99,5% Reinheit ergab und ~ 1,6 × 10 6 pro Mikrogliazellen neonatalen Gehirn 17. Unser Labor vor kurzem entwickelte eine säulenfreien CD11b magnetischen Trennverfahren 15, die wir mit Tagging CD11b mit einem monoklonalen Antikörper in einem Polystyrol – Röhrchen durchgeführt , konjugiert an Phycoerythrin (PE). Ein bispezifischer secondary Antikörper an PE und Dextran-Komplexe mit dem PE. Einmal gebunden, Dextran-beschichtete magnetische Partikel eingebracht, die an das Dextran Ende des Antikörper-Komplex binden. Schließlich wird die Polystyrol-Röhrchen in einem Magnet für Mikroglia-Isolierung angeordnet. Dieser Ansatz verdoppelte sich die Ausbeute auf ~ 3,2 x 10 6 Mikroglia pro neonatalen Gehirn , sondern auf Kosten der Reinheit reduziert auf ~ 97%.
Hier zeigen wir , eine schnelles und verfeinertes säulenfreien CD11b magnetische Trennung Protokoll (Abbildung 1). Diese verbesserte Methode bleibt wie möglich als unsere ursprüngliche säulenfreie Methode, da der Preis des CD11b magnetische Trennung Satzes gleich ist. Die Ausführungszeit wird in die Hälfte reduziert, was zur Maximierung der Ausbeute und das Überleben der Zellen von entscheidender Bedeutung sein kann. Bemerkenswerterweise ist die Reinheit von diesen optimierten Verfahren erreicht ~> 99%, eine deutliche Verbesserung gegenüber der Reinheit von dem ursprünglichen säulenfreien Verfahren durch unser Labor 15 entwickelt erreicht. Am wichtigsten ist, CD11b-PEnicht verwendet wird, von der Licht entfällt die Notwendigkeit, und die Verwendung des roten Kanal für die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht inkubieren entfernt. Schließlich ist, wie in dem ursprünglichen CD11b-Verfahren, eine astrozytären Fraktion von hohen Ausbeute und Reinheit mit diesem verbesserten Verfahren erhalten. Astrozyten sind die zahlreichen Gliazellen im ZNS, die Idee führt , dass ihre homöostatischen Funktionen 18 in Bezug auf Pathophysiologie unverzichtbar sind. Diese gliale Zellen spielen eine Rolle bei verschiedenen physiologischen Funktionen wie die Blut-Hirn-Schranke bilden, nährstoff Unterstützung, Neurotransmitter Aufrechterhaltung der Homöostase, bilden glial Narben in Reaktion auf eine Verletzung, Neuroprotektion, Lernen und Gedächtnis, und Neuroinflammation, beispielhaft ihre investigatory Potential in glial Biologie 19. Morphologie und Funktionalität von Mikroglia und Astrozyten wurden durch konfokale Mikroskopie, Western-Blot, quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR), G ermitteltRiess Nitrit-Test und der Multiplex-Zytokin-Assay Luminex. Die Verfeinerung dieses Protokoll zur Verfügung gestellt bietet mehr Vertrauen zu Mikroglia oder Astrozyten Reinheit, eine breitere Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie mit der Verfügbarkeit des roten Kanals betreffen, und spart Zeit, die alle für die in – vitro – Experimente wichtig sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ältere Mikroglia-Isolationsmethoden haben begrenzte Wiederherstellungen, die nicht geeignet sind für verschiedenes Protein durch Western-Blot-Analysen und RNA-Analysen durch qRT-PCR. Die differentielle Adhärenz und milde Trypsinisierung Methoden sind zwei gemeinsame Ansätze mit niedrigeren Ausbeuten Mikroglia 13, 14, 15. Die Säule basierte CD11b Ansatz hat auch eine geringe Erholung, aber erreicht eine höhere Reinheit als…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NS088206 und ES026892: Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (NIH) Grants unterstützt. Die W. Eugene und Linda Lloyd Stiftungslehrstuhl an AGK und Deans Professur AK werden hiermit anerkannt.
Materials
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
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