El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad
Summary
Aquí, se presenta un protocolo para aislar microglia de crías de ratón postnatal (día 1) para la experimentación in vitro. Este método improvisada de aislamiento genera tanto alto rendimiento y pureza, una ventaja significativa sobre métodos alternativos que permite amplia experimentación gama para los fines de elucidar la biología microglial.
Abstract
Microglia son los respondedores primarios a los insultos del sistema nervioso central; Sin embargo, aún queda mucho por conocer acerca de su papel en la regulación de la neuroinflamación. La microglía son las células del mesodermo que funcionan de manera similar a los macrófagos en topografía estrés inflamatorio. El (M1-tipo) clásico y (de tipo M2) alternativa activaciones de los macrófagos también se han extendido a la microglía en un esfuerzo por entender mejor la interacción subyacente estos fenotipos tienen en condiciones neuroinflammatory como el Parkinson, el Alzheimer y las enfermedades de Huntington. En la experimentación vitro utilizando microglia primaria proporciona resultados rápidos y fiables que pueden ser extendidas al ambiente en vivo. Aunque esta es una clara ventaja sobre la experimentación in vivo, aislar microglia, mientras que el logro de rendimientos adecuados de pureza óptima ha sido un reto. Los métodos comunes actualmente en uso ya sea sufren de baja recuperación, baja pureza, o ambos. Aquí, nos demtrar un refinamiento del método de separación magnética CD11b libre de columnas que logra una recuperación de células de alta y una mayor pureza en la mitad de la cantidad de tiempo. Proponemos este método optimizado como un modelo muy útil de aislamiento primaria microglial a los efectos de estudiar la neuroinflamación y la neurodegeneración.
Introduction
La microglía son macrófagos residentes Myb-independientes de origen mesodérmico, que diferencian de c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitores en las islas de sangre del saco vitelino 1, 2. Una vez microglia embriológicas han colonizado el sistema nervioso central (CNS), en su transición desde una ameboide a una forma ramificada 3. Estos microglia adultos se clasifican como surveillant ya que sus ramificaciones dinámicos para sondear el parénquima cerebral saludable para posibles insultos 4. Aunque microglia sólo contribuyen a aproximadamente el 10% de la población de células del SNC, su capacidad de baldosas entre sí asegura el escaneado máxima del parénquima 4, 5. Patrones de peligro asociado-moleculares (amortigua), tales como α-sinucleína 6, 7 y amiloide-β 8, o ppatrones moleculares athogen asociados-(PAMP), tales como el lipopolisacárido (LPS) 9, clásicamente activan microglia para promover una respuesta inflamatoria caracterizada por la reversión al estado activo ameboide y la producción de óxido nítrico, factor de necrosis tumoral-α (TNF), 1β interleucina ligando (IL-1β), IL-6, IL-12, y el motivo de quimioquinas CC 2 9, 10, 11. En condiciones neuroinflamatorios tales como la enfermedad de Parkinson, en los que patógena α-sinucleína ha acumulado, un ciclo neurodegenerativa se crea a partir de la muerte de las neuronas dopaminérgicas, que liberan más agregado α-sinucleína, promover aún más la activación clásica de la microglia 7. Similar a los macrófagos periféricos, microglia también puede tener la capacidad de activar alternativamente en presencia de las citoquinas antiinflamatorias IL-4 e IL-10, dándoles la potenteial de promover la reparación neural y atenuar la inflamación 2, 11. Aparte de sus papeles inmunológicos en el SNC, microglia se han descrito como reguladores vitales de circuitería neuronal mediante la poda sinapsis durante el desarrollo. Por ejemplo, los ratones KO Cx3cr1- tienen microglia menos densas y la reducción de la poda sináptica, lo que conduce a una sobreabundancia de las espinas dendríticas, las sinapsis inmaduras, y los patrones electrofisiológicas de un CNS subdesarrollado 12. La comprensión de estas complejidades fisiológicos y los diversos papeles funcionales de microglia en la homeostasis del SNC es crítica para la búsqueda de agentes terapéuticos dirigidos trastornos neurodegenerativos.
En el área de Neuroinmunología, los experimentos in vitro son muy deseables debido a la mayor viabilidad para estudios mecanísticos, los menores costes de mantenimiento, y por ser menos tiempo y mano de obra intensiva. Furthermore, la capacidad de aislar poblaciones de células es crítica para delinear la funcionalidad de aquellas células diana en las condiciones prescritas. Existen numerosos métodos de aislamiento microgliales, pero están limitados por su capacidad para obtener un número relativamente alto y de pureza de amplia experimentación 13, 14, 15. Por ejemplo, un grupo de 11b diferenciación (CD11b) es un marcador de superficie común de los monocitos, macrófagos y microglia 16. Mediante la explotación de CD11b, un método de separación magnética fue descrito primero como un enfoque basado en la columna que produjo ~ 99,5% de pureza y ~ 1,6 x 10 6 microglia por cerebro neonatal 17. Nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente un método libre de la columna CD11b magnético de separación 15, que se realizó en un tubo de poliestireno mediante el etiquetado de CD11b con un anticuerpo monoclonal conjugado con ficoeritrina (PE). Una seconda biespecíficoanticuerpo ry a PE y complejos de dextrano con la PE. Una vez unido, se introducen partículas magnéticas revestido con dextrano, que se unen al extremo de dextrano del complejo de anticuerpo. Por último, el tubo de poliestireno se coloca en un imán para el aislamiento microglial. Este enfoque se duplicó el rendimiento de ~ 3,2 x 10 6 microglia por cerebral neonatal, pero a costa de reducir la pureza de ~ 97%.
En este documento, se demuestra un protocolo de separación rápida y refinado libre de columnas CD11b magnético (Figura 1). Este método mejorado sigue siendo tan factible como nuestro método libre de columna original ya que el precio del kit de separación magnética CD11b es el mismo. El tiempo de terminación se reduce en un medio, que puede ser crucial para maximizar la supervivencia celular y el rendimiento. Notablemente, la pureza logrado a partir de este método es optimizado ~> 99%, una mejora con respecto a la pureza alcanzado desde el método original libre de columnas desarrollado por nuestro laboratorio 15. Lo más importante, CD11b-PEno se utiliza, eliminando la necesidad de incubar lejos de la luz y permitiendo el uso del canal rojo para microscopía de fluorescencia. Por último, como en el método original CD11b, una fracción de los astrocitos de alto rendimiento y pureza se obtiene con este método mejorado. Los astrocitos son las más numerosas células gliales en el sistema nervioso central, dando lugar a la idea de que sus funciones homeostáticas son indispensables en relación con la fisiopatología 18. Estas células gliales juegan un papel en diversas funciones fisiológicas, tales como la formación de la barrera sangre-cerebro, proporcionando soporte de nutrientes, mantenimiento de la homeostasis de neurotransmisores, formando cicatrices gliales en respuesta a una lesión, la neuroprotección, el aprendizaje y la memoria, y la neuroinflamación, ejemplificando su potencial de investigación en glial biología 19. Morfología y funcionalidad de la microglia y astrocitos se han comprobado a través de microscopía confocal, Western Blot, cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR), Gensayo de nitrito Riess, y el ensayo multiplex de citocinas Luminex. El refinamiento proporcionada por este protocolo ofrece una mayor confianza perteneciente a la pureza de la microglia o los astrocitos, una aplicación más amplia de microscopía de fluorescencia con la disponibilidad del canal rojo, y ahorra tiempo, todos los cuales son importantes para la experimentación in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
métodos de aislamiento microgliales mayores tienen recuperaciones limitadas que no son apropiados para diversos análisis de proteína por Western blot y análisis de ARN mediante qRT-PCR. La adherencia diferencial y métodos tripsinización leves son dos enfoques comunes con bajos rendimientos microgliales 13, 14, 15. El enfoque CD11b basado en columnas también tiene una baja recuperación, pero consigue una mayor pureza que…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Subvenciones: NS088206 y ES026892. La W. Eugene y Linda Cátedra Lloyd a AGK y decanos Cátedra de AK también son reconocidas.
Materials
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
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