Snabb och Raffinerad CD11b Magnetic Isolering av primär mikroglia med förbättrad renhet och mångsidighet
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera mikroglia från postnatala musungar (dag 1) för in vitro experiment. Denna improviserade metod för isolering genererar både högt utbyte och renhet, en betydande fördel jämfört med alternativa metoder som tillåter brett område experimenterande i syfte att belysa microglial biologi.
Abstract
Mikroglia är de primära responders till centrala nervsystemet förolämpningar; Men mycket är okänd om sin roll i regleringen av neuroinflammation. Mikroglia är mesodermala celler som fungerar på liknande sätt till makrofager i lantmäteri inflammatorisk stress. Den klassiska (M1-typ) och alternativa (M2-typ) aktiveringar av makrofager har också utvidgats till mikroglia i ett försök att bättre förstå den underliggande samspelet dessa fenotyper har i neuroinflammatoriska sjukdomar såsom Parkinsons, Alzheimers och Huntingtons sjukdomar. In vitro experiment använder primära mikroglia erbjuder snabba och tillförlitliga resultat som kan utvidgas till in vivo miljö. Även om detta är en klar fördel gentemot in vivo experiment, isolera mikroglia och samtidigt uppnå tillräcklig avkastning av optimal renhet har varit en utmaning. Vanliga metoder för närvarande är i bruk antingen lider av låg återhämtning, låg renhet, eller bådadera. Häri vi markonstrate en förfining av kolonnen fria CD11b magnetisk separationsmetod som uppnår en hög cellåtervinning och ökad renhet i halv mängden tid. Vi föreslår denna optimerade metod som en mycket användbar modell av primär microglial isolering i syfte att studera neuroinflammation och neurodegeneration.
Introduction
Mikroglia är Myb-oberoende residenta makrofager av mesodermalt ursprung, som skiljer från c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitorer i blod öarna i gulesäcken 1, 2. Gång embryologiska mikroglia har koloniserat det centrala nervsystemet (CNS), de går över från en amöboid till en förgrenad formen 3. Dessa vuxna mikroglia klassificeras som surveillant eftersom deras dynamiska förgreningar sondera friska hjärnparenkymet för potentiella förolämpningar 4. Fastän mikroglia bara att bidra till ungefär 10% av CNS-cellpopulationen, deras förmåga att kakel bland varandra säkerställer maximal scanning av parenkymet 4, 5. Fara-associerade molekylära mönster (dämpas), såsom α-synuklein 6, 7 och amyloid-β 8, eller pathogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) såsom lipopolysackarid (LPS) 9, klassiskt aktivera mikroglia att främja ett inflammatoriskt svar som kännetecknas av återgång till amöboid aktivt tillstånd och produktionen av kväveoxid, tumörnekrosfaktor-α (TNFa), interleukin 1β (IL-1β), IL-6, IL-12, och kemokinen CC-motivet ligand 2 9, 10, 11. I neuroinflammatoriska tillstånd, såsom Parkinsons sjukdom, i vilka patogena α-synuklein har ackumulerats, är en neurodegenerativ cykel skapas från döden av dopaminerga neuroner, vilka frisätter mer aggregerad α-synuklein, ytterligare främja klassisk aktivering av mikroglia 7. Liknar perifera makrofager, kan mikroglia också ha förmåga att alternativt aktivera i närvaro av de anti-inflammatoriska cytokiner IL-4 och IL-10, vilket ger dem den potentaial främja neurala reparation och dämpning av inflammation 2, 11. Bortsett från deras immunologiska roller i CNS har mikroglia beskrivits som viktiga regulatorer av neuronal kretsar genom beskärning synapser under utveckling. Exempelvis Cx3cr1- KO möss har mindre täta mikroglia och minskad synaptisk beskärning, vilket leder till ett överflöd av Dendritutskotten, omogna synapser och de elektrofysiologiska mönster av en underutvecklad CNS 12. Att förstå dessa fysiologiska komplexitet och de olika funktionella roller mikroglia i homeostasen av CNS är avgörande för sökandet efter läkemedel riktade neurodegenerativa sjukdomar.
I området för neuroimmunologi, in vitro-experiment är mycket önskvärda på grund av den större genomförbarhet för mekanistiska studier, de lägre underhållskostnader, och för att vara mindre tids- och arbetskrävande. Furthermore, är förmågan att isolera cellpopulationer kritiskt att beskriva funktionaliteten hos dessa målceller under föreskrivna betingelser. Talrika mikrogliala isoleringsmetoder finns, men de är begränsade genom sin förmåga att erhålla relativt höga antal och renhet för bred försöks 13, 14, 15. Till exempel, är ett kluster av differentiering 11b (CD11b) en gemensam ytmarkör av monocyter, makrofager och mikroglia 16. Genom att utnyttja CD11b, var en metod för magnetisk separation först beskrevs som en kolumn baserat tillvägagångssätt som gav ~ 99,5% renhet och ~ 1,6 x 10 6 mikroglia per neonatal hjärna 17. Vårt laboratorium nyligen utvecklat en kolonn fritt CD11b magnetisk separationsmetoden 15, som vi utfört i ett polystyrenrör genom att märka CD11b med en monoklonal antikropp konjugerad till fykoerytrin (PE). En bispecifik secondary antikropp till PE och dextran komplex med PE. En gång bundna, är dextran-belagda magnetiska partiklar införs, som binder till dextran änden av antikroppskomplexet. Slutligen är polystyrenrör placerades i en magnet för microglial isolering. Detta tillvägagångssätt fördubblade utbytet till ~ 3,2 x 10 6 mikroglia per neonatal hjärna men till priset av att minska renheten till ~ 97%.
Häri, visar vi en snabb och raffinerad kolonn fria CD11b magnetisk separation protokollet (figur 1). Detta förbättrade förfarande förblir lika genomförbart som vår ursprungliga kolonn-fri metod eftersom priset av CD11b magnetisk separation kit är densamma. Slutförtiden minskas i halv, vilket kan vara avgörande för att maximera cellöverlevnad och utbyte. Notably, renheten uppnås från denna optimerade metod är ~> 99%, en markant förbättring jämfört med renheten uppnås från den ursprungliga kolonnen fria metod som utvecklats av vårt laboratorium 15. Viktigast CD11b-PEutnyttjas inte, vilket eliminerar behovet att inkubera borta från ljus och medger användning av den röda kanalen för fluorescensmikroskopi. Slutligen, som i den ursprungliga CD11b metoden, är en astrocytisk fraktion av högt utbyte och renhet erhålles med denna förbättrade metod. Astrocyter är de mest talrika gliaceller i CNS, vilket leder till tanken att deras homeostatiska funktioner är oumbärliga i förhållande till patofysiologi 18. Dessa gliaceller spela en roll i olika fysiologiska funktioner såsom formning av blod-hjärnbarriären, som ger näringsämne stöd, upprätthålla signalsubstans homeostas, bildar gliala ärr som svar på skada, neuroskydd, inlärning och minne, och neuroinflammation, exemplifierar deras utrednings potential i glia biologi 19. Morfologi och funktionaliteten hos mikroglia och astrocyter har konstaterats via konfokalmikroskopi, Western blotting, kvantitativ realtids-Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR), GRiess nitritanalysen, och Luminex multiplex cytokin analys. Förfining som tillhandahålls av detta protokoll erbjuder ökat förtroende avseende microglial eller astrocytisk renhet, bredare tillämpning av fluorescensmikroskopi med tillgängligheten av den röda kanalen, och sparar tid, som alla är viktiga för in vitro-experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Äldre microglial isoleringsmetoder ha begränsade återvinningar som inte är lämpliga för olika proteinanalyser genom Western blöt och RNA-analyser av QRT-PCR. Differential vidhäftning och milda trypsinbehandling metoder är två vanliga metoder med låga microglial utbyten 13, 14, 15. Kolonnen baserade CD11b tillvägagångssätt har också låg återhämtning, men uppnår större renhet än differentiell vidhäftning och…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) Grants: NS088206 och ES026892. W. Eugene och Linda Lloyd Begåvad ordförande att AGK och Deans professur till AK är också erkänt.
Materials
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
References
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
- Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson’s disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
- Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson’s disease. 신경과학. 302, 89-102 (2015).
- Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).
- Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson’s Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
- Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson’s Disease: Foe and ally?. 신경과학. 302, 59-73 (2015).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma, ., J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
- Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
- Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
- Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson’s disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
- Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).
