Summary

السيطرة التعبير قناة ايون من خلال ترنسفكأيشن عابر محرض

Published: February 17, 2017
doi:

Summary

أصبح يدرس القنوات الأيونية من خلال نظام معربا عن heterologously تقنية الأساسية في البحوث الطبية الحيوية. في هذه المخطوطة، فإننا نقدم وسيلة فعالة وقت لتحقيق رقابة مشددة التعبير القناة الايونية عن طريق أداء ترنسفكأيشن عابرة تحت سيطرة المروج محرض.

Abstract

ترنسفكأيشن، وتسليم من الأحماض النووية الأجنبية في خلية، هو أداة قوية في مجال البحوث البروتين. من خلال هذه الطريقة، يمكن التحقيق القنوات الأيونية من خلال تحليل الكهربية، وتوصيف الكيمياء الحيوية، ودراسات طفرية، وتأثيرها على العمليات الخلوية. تعداء عابرة تقدم بروتوكول بسيط في الذي يصبح فيه البروتين المتاحة للتحليل في غضون بضع ساعات إلى أيام. على الرغم من أن يقدم هذا الأسلوب بروتوكول كفاءة واضحة والوقت نسبيا، واحدة من العناصر الأساسية ومعايرة التعبير عن الجينات التي تهم المستويات ذات الصلة الفسيولوجية أو المستويات التي هي مناسبة للتحليل. تحقيقا لهذه الغاية، وقد ظهرت العديد من الطرق المختلفة التي توفر القدرة على التحكم في التعبير عن الجينات في المصالح. توفر عدة مستقرة بروتوكولات خلية ترنسفكأيشن وسيلة لإدخال دائمة الجين في الجينوم الخلوي تحت تنظيم وtranscrip التي تسيطر عليها التتراسيكلينتفعيل tional. في حين أن هذا الأسلوب تنتج مستويات التعبير موثوق بها، كل الجينات في المصالح يتطلب بضعة أسابيع من العمل المهرة بما في ذلك معايرة منحنى القتل، واختيار من مستعمرات الخلايا، وأكثر عموما الموارد. هنا نقدم البروتوكول الذي يستخدم ترنسفكأيشن عابرة من المحتمل قناة الموجبة أعضاء فصيلة V جينات مستقبلات عابر 1 (TRPV1) في نظام محرض وسيلة فعالة للتعبير عن البروتين في الطريقة التي تسيطر عليها والتي لا غنى عنها في تحليل القناة الايونية. علينا أن نظهر أن استخدام هذه التقنية، ونحن قادرون على أداء التصوير الكالسيوم، خلية كاملة، وتحليل قناة واحدة مع مستويات قناة تسيطر المطلوبة لكل نوع من جمع البيانات مع ترنسفكأيشن واحد. وعموما، هذا يوفر تقنية قابلة للتكرار والتي يمكن استخدامها لدراسة هيكل القنوات الأيونية وظيفة.

Introduction

معربا عن Heterologously أنظمة هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع لدراسة العديد من الوظائف الخلوية 1. جعلت لها الانظار الذاتية البروتين، ومتطلبات الحد الأدنى من الصيانة، والنمو موثوق بها، والقدرة على تناول وتعبير عن الحمض النووي الأجانب خطوط الخلايا مثل الجنينية البشرية الكلى (HEK293) والصينية الهامستر المبيض (CHO) تقريبا من الضروري ان الأبحاث البيولوجية 2 و 3. وتشمل مجالات البحث باستخدام أنظمة مغاير بروتينات الغشاء، مما يشير الى داخل الخلايا، والنشاط الأنزيمي. بعد ترنسفكأيشن من الحمض النووي الأجانب إلى داخل الخلية، والعديد من أشكال مختلفة من التحليل يمكن أن يؤديها، بما في ذلك الكهربية، والتصوير الكالسيوم ratiometric، لطخة غربية، الخ 5.

ويرجع ذلك إلى مجموعة واسعة من التطبيقات المحتملة للأنظمة تعبير مغايرة، وكثير من احوقد وضعت الكواشف والمنتجات الشمالي للاستفادة من هذه الخلايا وصفاتهم 6. نظم تسليم الحمض النووي التي عابر أو دائم دمج الحمض النووي الأجانب إلى داخل الخلايا لدراسة البروتين دخيلة أصبحت واحدة من أكثر الأدوات شعبية ومفيدة للبحث البيولوجي. وبشكل أكثر تحديدا، ويستخدم على نطاق واسع transfecting عابر الحمض النووي في الخلية على أنها عملية بسيطة، مباشرة إلى الأمام التي تتطلب القليل نسبيا من الوقت والمواد. وعلاوة على ذلك، فإن نسبة النجاح من الخلايا التي تخضع ترنسفكأيشن مرتفع 7. هذه التقنية هي موثوقة جدا عندما جنبا إلى جنب مع الجين علامة مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، ويمكن استخدامها في العديد من التقنيات المختلفة مثل التصوير الكالسيوم والكهربية 5. للأسف، على الرغم من، معربا عن عابر الحمض النووي في الخلايا المضيفة يأتي مع بعض العثرات الرئيسية، وليس في الأقل مستوى التعبير في الخلية لا يمكن الاعتماد عليها. عدد النسخ من البلازميد اتخذت شص في الخلية لا يمكن السيطرة عليها، وبالتالي فإن التعبير بين التجارب الفردية يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا 2. تصبح هذه قضية هامة عند أي محاولة لمحاكاة الظروف الفسيولوجية، أو أداء تقنيات دقيقة لجمع البيانات.

كحل للمضاعفات المذكورة أعلاه، وقد تم تصميم بروتوكولات ترنسفكأيشن مستقرة يمكن من خلالها إدخال الجين في جينوم الخلية تحت رقابة مشددة من المروج محرض، مثل نظام التتراسيكلين التعبير كاظمة، وضمان واحد نسخة من البلازميد يدمج في جينوم كل خلية، ويعبر عنها إلا بعد تحريض آلية النسخ، على سبيل المثال، في حضور الدوكسيسيكلين. في حين أن هذا لا يحل العقبات من مستويات بروتين تعبير متناسقة، يفقد هذه الطريقة راحة بروتوكول سريعة وبسيطة نسبيا من تعداء عابر. إنشاء خط الخلية مستقرة يأخذ أسابيع قليلة على الأقل في حركتيح واحد يجب معايرة منحنى قتل من قبل المضادات الحيوية المحددة للحفاظ على التعبير البروتين وضمان التكامل بين ناقلات وبمهارة تحديد وتنمو المستعمرات الخلية. عموما هذا يأخذ مزيدا من الوقت والجهد مع انخفاض نسبة النجاح 8.

هنا، ونحن نقدم بروتوكول المتوسطة التي تعتمد على نقاط القوة في كل من الخيارات ترنسفكأيشن شعبية لتوفير وسيلة بسيطة وفعالة للسيطرة على مستويات التعبير في أي خط الخلية محرض. مع الحفاظ على الخلايا مع نظام تيت محرض، نحن عابر transfect لدينا الجينات في المصالح، عابر مستقبلات المحتملة قناة الموجبة أعضاء فصيلة V 1 (TRPV1)، ligated في ناقلات التي يمكن أن تجمع بين homologously مع نظام قامع. وبهذه الطريقة، يمكن إدخال الجين في الخلايا دون بدأوا يعبرون. فقط مع إضافة الدوكسيسيكلين لم تبدأ الجينات للتعبير، مما يسمح لنا لمعايرة مستويات البروتين EXPRession وفقا لتقنية أو المستويات التي سجلت في الظروف الفسيولوجية. كما يتجنب بروتوكول لدينا مضاعفات طويلة المرتبطة توليد خط خلية التعبير عن ثابت. نبدأ من خلال إظهار تغير مستويات تفعيل TRPV1 في التصوير الكالسيوم من الامم المتحدة التي يسببها من خلال أربع ساعات من تحريض وكيف ارتفاع مستويات الكالسيوم داخل الخلايا يرتبط. نحن ثم تكرار البروتوكول في تكوين خلية كاملة من تقنية المشبك التصحيح، والتي تبين تيار متزايد مع زيادة الوقت من الاستقراء. وأخيرا، فإننا نقدم أمثلة من التسجيلات الكهربية قناة واحدة، وتبين أن هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للتعبير تسيطر عليها عندما تبحث عن جمع البيانات الدقيقة على أساس الوحدات الفردية من البروتين. من خلال بروتوكول لدينا، ونحن نقدم وسيلة مريحة للسيطرة على التعبير البروتين في النظم مغاير مع تجنب المضاعفات زراعة الخلايا طويلة، وبالتالي توفير وسيلة للسيطرة على الأوضاع بين التجارب وتوفير موإعادة النتائج قابلة للتكرار.

Protocol

1. Ligating الجينات الاهتمام في الموقع كظوم من المتجهات الحصول على ناقلات محرض مثل pcDNA5 / FRT / للأو pcDNA4 / لل. تحليل الجينات في المصالح لأي تقييد مواقع يحتمل أن تكون عرضة في منتصف الجينات التي هي وارد?…

Representative Results

بسرعة لخلق نموذج التعبير محرض، التي قطعناها على أنفسنا استخدام الخلايا HEK293 التي تعبر عن بروتين التتراسيكلين كاظمة (TR) (على سبيل المثال، T-REX-293) وناقلات التي تحتوي على تسلسل المشغل التتراسيكلين (تيتو) بين المروج CMV وموقع استنساخ متعددة (على سبيل…

Discussion

ترنسفكأيشن هو بروتوكول يستخدم على نطاق واسع للتعبير البروتين والبحوث، مع العديد من الأشكال المختلفة لتحسين الاتساق التعبير والاستقرار. توفر الكواشف ترنسفكأيشن عابرة بسيطة وسهلة لاستخدام بروتوكول حيث يمكن تحليل الخلايا والبروتين من الفائدة خلال ساعات ليلة وضحاها …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم اسرائيل [المنح 1721-1712، 1368-1312، و1444-1416] (لا ف ب). ويتبع AP مع مركز Brettler وديفيد ر مركز بلوم، كلية الصيدلة، جامعة العبرية في القدس.

Materials

pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit Invitrogen K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler Esco  n.a
Restriction Enzymes ThermoScientific Fisher ER0501
Agarose  Lonza 50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
NanoDrop 2000c ThermoScientific Fisher ND-2000C
T4 DNA Ligase ThermoScientific Fisher EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli ThermoScientific Fisher C404006 
Ampicillin (Sodium), USP Grade Gold Bio A-301-5
Tryptone for microbiology Merck 6.19305E+13
Yeast Extract BD worldwide 212750
 SIF6000R Incubated Shaker LAB COMPANION 45H118

NucleoSpin®plasmid
Macherey Nagel 740588.25
MS 300V Power Supply Major Science MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System ThermoScientific Fisher B1A
T-REx™-293 cell line Invitrogen R710-07
DMEM (1X), liquid (high glucose) Gibco 41965-039
HindIII-HF® NEB R3104S
ApaI NEB R0114S
CutSmart® Buffer NEB B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V102520
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin Gibco 10270106
HEPES Buffer Solution (1 M) Biological Industries 03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution Biological Industries 03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) Biological Industries 03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator ThermoScientific Fisher 51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet ThermoScientific Fisher 51025411
Blasticidine S hydrochloride Sigma-Aldrich 15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride Sigma-Aldrich D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER Hausser Scientific 31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent Mirus MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round Knittel Glass GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine Corning 354210
Water, Cell Culture Grade Biological Industries 03-055-1A
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-1G
Fura-2, AM ester Biotium BTM-50034
Pluronic® F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
µ-Slide 8 Well ibidi 80826
(E)-Capsaicin Tocris 462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope Olympus n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher Sutter Instruments n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera QImaging n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software Molecular Devices n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing Sutter Instruments B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing Sutter Instruments B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous Sigma-Aldrich 276855
P1000 micropipette puller Sutter Instruments P-1000
MF-900 Microforge NARISHIGE n.a
ValveBank perfusion sysytem AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System Molecular Devices n.a
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices n.a
pCLAMP 10.6 Software Molecular Devices n.a
micromanipulator Sutter Instruments MP-225

References

  1. Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization. Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).
  2. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  3. Xu, X., Nagarajan, H., et al. The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
  4. Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry. Scientific reports. 5, 12278 (2015).
  5. Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics. Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).
  6. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  7. Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells. Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).
  8. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  9. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  10. Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain. Cell. 141 (5), 834-845 (2010).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).
  13. Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels. J Vis Exp. (71), e4209 (2013).

Play Video

Cite This Article
Geron, M., Hazan, A., Priel, A. Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection. J. Vis. Exp. (120), e55370, doi:10.3791/55370 (2017).

View Video