Summary

Contrôlable Expression Ion canal par transfection transitoire inductible

Published: February 17, 2017
doi:

Summary

Étudier les canaux ioniques à travers un système exprimant de manière hétérologue est devenue une technique de base dans la recherche biomédicale. Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode efficace de temps pour obtenir l'expression du canal ionique étroitement contrôlé en effectuant une transfection transitoire sous le contrôle d'un promoteur inductible.

Abstract

La transfection, la délivrance d'acides nucléiques étrangers dans une cellule, est un puissant outil pour la recherche de protéines. Grâce à cette méthode, les canaux ioniques peuvent être étudiés par analyse électrophysiologique, la caractérisation biochimique, des études mutationnelles et leurs effets sur les processus cellulaires. Des transfections transitoires proposent un protocole simple dans lequel la protéine est disponible pour l'analyse au bout de quelques heures à quelques jours. Bien que cette méthode présente un protocole efficace relativement simple et le temps, l'un des éléments essentiels est l'étalonnage de l'expression du gène d'intérêt à des niveaux pertinents physiologiques ou des niveaux qui sont adaptés à l'analyse. A cet effet, de nombreuses approches différentes qui offrent la possibilité de contrôler l'expression du gène d'intérêt sont apparus. Plusieurs protocoles de transfection de cellules stables constituent un moyen d'introduire de façon permanente un gène d'intérêt dans le génome cellulaire sous la régulation d'une transcriptase tétracycline contrôléeactivation tional. Bien que cette technique produit des niveaux d'expression fiables, chaque gène d'intérêt nécessite quelques semaines de travail qualifié y compris l'étalonnage d'une courbe de mise à mort, la sélection des colonies de cellules, et dans l'ensemble plus de ressources. Ici, nous présentons un protocole utilisant une transfection transitoire de l'élément de potentiel sous-famille V du canal de cation 1 (TRPV1), le gène transitoire de récepteur dans un système inductible comme un moyen efficace pour exprimer une protéine de manière contrôlée ce qui est essentiel dans l'analyse du canal ionique. Nous démontrons que l'utilisation de cette technique, nous sommes en mesure d'effectuer l'imagerie calcique, cellules entières, et l'analyse de canal unique avec des niveaux de canaux contrôlés requis pour chaque type de collecte de données avec une seule transfection. Dans l'ensemble, cela fournit une technique réplicable qui peut être utilisée pour étudier les canaux ioniques structure et fonction.

Introduction

Systèmes exprimant hétérologue est l' une des techniques les plus couramment utilisées pour étudier une multitude de fonctions cellulaires 1. Leur faible profil endogène des protéines, un minimum d'entretien, la croissance fiable, et la capacité de prendre et d' exprimer l' ADN étranger ont fait des lignées cellulaires telles que rein embryonnaire humain (HEK293) et ovaire de hamster chinois (CHO) presque indispensable à la recherche biologique 2, 3. Les domaines de recherche en utilisant des systèmes hétérologues comprennent des protéines membranaires, la signalisation intracellulaire, et l'activité enzymatique. Après la transfection d'ADN étranger dans la cellule, de nombreuses formes différentes d'analyse peuvent être effectués, y compris l' électrophysiologie, l' imagerie calcique ratiométrique, western blot, etc. 4, 5.

En raison de la vaste gamme d'applications potentielles pour les systèmes d'expression hétérologues, beaucoup différedes réactifs et des produits nt ont été développés pour utiliser ces cellules et leurs qualités 6. systèmes de délivrance d'ADN qui transitoirement ou définitivement intégrer l'ADN étranger dans des cellules pour étudier la protéine exogène est devenu l'un des outils les plus populaires et utiles pour la recherche biologique. Plus précisément, la transfection transitoire d'ADN dans une cellule est largement utilisé comme un processus simple et directe qui nécessite relativement peu de temps et de matériaux. En outre, le taux de succès des cellules qui subissent une transfection 7 est élevée. Cette technique est très fiable lorsqu'elle est associée à un gène marqueur tel que la protéine fluorescente verte (GFP), et peut être utilisé pour de nombreuses techniques différentes telles que l' imagerie du calcium et 5 électrophysiologie. Malheureusement, cependant, exprimant de manière transitoire l'ADN dans des cellules hôtes est livré avec quelques écueils majeurs, pas le moins que le niveau d'expression par cellule est peu fiable. Le nombre de copies d'ADN de plasmide prise up par cellule est incontrôlable, donc l'expression entre les expériences individuelles peut varier considérablement 2. Cette question devient importante lorsque l'essayer de reproduire les conditions physiologiques, ou d'effectuer des techniques de collecte de données précises.

En tant que solution aux complications mentionnées ci-dessus, des protocoles de transfection stables ont été conçues dans lesquelles un gène d'intérêt peut être inséré dans le génome d'une cellule sous le contrôle étroit d'un promoteur inductible, tel qu'un système de tetracycline répresseur de l'expression, assurant une seule copie du plasmide intègre dans le génome de chaque cellule et est exprimé uniquement après l'induction du mécanisme de transcription, par exemple, en présence de doxycycline. Bien que cela résout les obstacles de niveaux d'expression de protéines incompatibles, cette méthode perd la commodité du protocole rapide et relativement simple de transfections transitoires. L'établissement d'une lignée cellulaire stable prend au moins quelques semaines à which on doit étalonner une courbe de mise à mort fixé par des antibiotiques spécifiques pour maintenir l'expression de protéines et d'assurer l'intégration du vecteur et habilement sélectionner et cultiver des colonies de cellules. Dans l' ensemble cela prend beaucoup plus de temps et d' effort avec un taux de réussite inférieur 8.

Ici, nous présentons un protocole intermédiaire qui appuie sur les points forts des deux options de transfection populaires pour fournir un moyen simple et efficace pour contrôler les niveaux d'expression dans toute lignée cellulaire inductible. Tout en conservant les cellules avec un système Tet inductible, nous transfecter transitoirement notre gène d'intérêt, le récepteur transitoire canal cationique sous-famille V membre potentiel 1 (TRPV1), ligaturé dans un vecteur qui peut se combiner avec l'homologue système répresseur. De cette manière, le gène peut être introduit dans les cellules sans commencer à exprimer. Seulement avec l'ajout de doxycycline ne le gène commence à exprimer, ce qui nous permet d'étalonner les niveaux de protéines expression selon la technique ou à des niveaux observés dans des conditions physiologiques. Notre protocole permet également d'éviter de longues complications associées à la génération d'une lignée cellulaire exprimant de manière stable. Nous commençons par montrer l'évolution des niveaux d'activation de TRPV1 en imagerie de calcium à travers quatre heures d'induction et comment la hausse des taux de calcium intracellulaire est corrélée induite non. Nous avons ensuite dupliquer le protocole dans la configuration cellule entière de la technique du patch clamp, montrant le courant augmente avec le temps de l'induction de plus en plus. Enfin, nous présentons des exemples d'enregistrements individuels d'électrophysiologie de canal, et de montrer que cette technique est particulièrement utile pour l'expression contrôlée lors de la recherche pour la collecte de données précises sur la base de différentes unités de la protéine. Grâce à notre protocole, nous offrons un moyen pratique pour contrôler l'expression des protéines dans des systèmes hétérologues, tout en évitant de longues complications de culture cellulaire, fournissant ainsi un moyen de contrôler les conditions entre les expériences et fournir des more des résultats reproductibles.

Protocol

1. ligaturer le gène d'intérêt dans le site répressible de Vector Obtenir un vecteur inductible tel que pcDNA5 / FRT / TO ou pcDNA4 / TO. Analyser le gène d'intérêt pour tous les sites de restriction potentiellement sensibles dans le milieu du gène qui sont également dans le site de clonage multiple du vecteur choisi par un logiciel d'analyse d'ADN silico 4. Des techniques utilisant de chevauchement PCR standard 4,…

Representative Results

Pour créer rapidement un modèle d'expression inductible, nous avons utilisé des cellules HEK293 qui expriment la protéine tétracycline répresseur (TR) (par exemple, T-REx-293) et des vecteurs qui contiennent des séquences d'opérateur de tétracycline (TetO) entre le promoteur CMV et le site de clonage multiple (par exemple, pcDNA4 / TO). Lorsqu'il est transfecté dans des cellules 293-trex, l'expression du gène d'intérêt dans pcDNA4 / TO e…

Discussion

Transfection est un protocole largement utilisé pour l'expression des protéines et de la recherche, avec de nombreuses variantes différentes pour améliorer la cohérence et la stabilité expression. réactifs de transfection transitoire offrent un moyen simple, facile à utiliser le protocole où la cellule et la protéine d'intérêt peuvent être analysés dans les heures durant la nuit à partir du moment de la transfection. Malheureusement , cette approche peut être imprévisible lorsque le mode d'a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Fondation Israël Sciences [Subventions 1721/12, 1368/12 et 1444/16] (AP). AP est affilié à Brettler Center et David R. Bloom Centre, Faculté de Pharmacie, Université hébraïque de Jérusalem.

Materials

pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit Invitrogen K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler Esco  n.a
Restriction Enzymes ThermoScientific Fisher ER0501
Agarose  Lonza 50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
NanoDrop 2000c ThermoScientific Fisher ND-2000C
T4 DNA Ligase ThermoScientific Fisher EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli ThermoScientific Fisher C404006 
Ampicillin (Sodium), USP Grade Gold Bio A-301-5
Tryptone for microbiology Merck 6.19305E+13
Yeast Extract BD worldwide 212750
 SIF6000R Incubated Shaker LAB COMPANION 45H118

NucleoSpin®plasmid
Macherey Nagel 740588.25
MS 300V Power Supply Major Science MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System ThermoScientific Fisher B1A
T-REx™-293 cell line Invitrogen R710-07
DMEM (1X), liquid (high glucose) Gibco 41965-039
HindIII-HF® NEB R3104S
ApaI NEB R0114S
CutSmart® Buffer NEB B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V102520
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin Gibco 10270106
HEPES Buffer Solution (1 M) Biological Industries 03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution Biological Industries 03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) Biological Industries 03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator ThermoScientific Fisher 51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet ThermoScientific Fisher 51025411
Blasticidine S hydrochloride Sigma-Aldrich 15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride Sigma-Aldrich D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER Hausser Scientific 31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent Mirus MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round Knittel Glass GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine Corning 354210
Water, Cell Culture Grade Biological Industries 03-055-1A
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-1G
Fura-2, AM ester Biotium BTM-50034
Pluronic® F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
µ-Slide 8 Well ibidi 80826
(E)-Capsaicin Tocris 462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope Olympus n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher Sutter Instruments n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera QImaging n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software Molecular Devices n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing Sutter Instruments B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing Sutter Instruments B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous Sigma-Aldrich 276855
P1000 micropipette puller Sutter Instruments P-1000
MF-900 Microforge NARISHIGE n.a
ValveBank perfusion sysytem AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System Molecular Devices n.a
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices n.a
pCLAMP 10.6 Software Molecular Devices n.a
micromanipulator Sutter Instruments MP-225

References

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Cite This Article
Geron, M., Hazan, A., Priel, A. Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection. J. Vis. Exp. (120), e55370, doi:10.3791/55370 (2017).

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