Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Summary

El estudio de los canales iónicos a través de un sistema de expresión de forma heteróloga se ha convertido en una técnica básica en la investigación biomédica. En este manuscrito, se presenta un método eficiente de tiempo para conseguir la expresión del canal iónico fuertemente controlada mediante la realización de la transfección transitoria bajo el control de un promotor inducible.

Abstract

La transfección, la entrega de ácidos nucleicos extraño en una célula, es una herramienta poderosa en la investigación de proteínas. A través de este método, los canales iónicos pueden ser investigados por medio del análisis electrofisiológico, caracterización bioquímica, los estudios mutacionales, y sus efectos sobre los procesos celulares. Las transfecciones transitorias ofrecen un protocolo simple en el que la proteína se convierte en disponible para el análisis dentro de unas pocas horas a días. Aunque este método presenta un protocolo eficiente relativamente sencillo y el tiempo, uno de los componentes críticos es calibrar la expresión del gen de interés a niveles fisiológicos relevantes o niveles que son adecuados para el análisis. Con este fin, han surgido muchos enfoques diferentes que ofrecen la capacidad de controlar la expresión del gen de interés. Varios protocolos de transfección de células estables proporcionan una manera de introducir de forma permanente un gen de interés en el genoma celular bajo la regulación de una trascripción controlado por tetraciclinala activación cional. Si bien esta técnica produce niveles de expresión fiables, cada gen de interés requiere de algunas semanas de trabajo cualificado incluyendo la calibración de una curva de muerte, selección de colonias de células, y en general más recursos. Aquí se presenta un protocolo que utiliza la transfección transitoria del gen 1 canal catiónico miembro potencial subfamilia V Transient Receptor (TRPV1) en un sistema inducible como un medio eficaz para expresar una proteína de una manera controlada que es esencial en el análisis del canal iónico. Se demuestra que el uso de esta técnica, que son capaces de realizar las imágenes de calcio, células enteras, y el análisis de un solo canal con niveles de los canales controlados requeridos para cada tipo de recolección de datos con una única transfección. En general, esto proporciona una técnica replicable que puede ser usado para estudiar la estructura y la función de los canales iónicos.

Introduction

Heteróloga expresa sistemas es una de las técnicas más utilizadas para el estudio de una multitud de funciones celulares ^1. Su perfil bajo proteína endógena, los requisitos mínimos de mantenimiento, el crecimiento fiable, y la capacidad de captar y expresar ADN foráneo han hecho líneas celulares tales como embrionarias de riñón humano (HEK293) y de ovario de hámster chino (CHO) casi imprescindible para la investigación biológica ^{2, 3.} Las áreas de investigación incluyen el uso de sistemas heterólogos proteínas de membrana, la señalización intracelular y la actividad enzimática. Después de la transfección de ADN extraño en la célula, muchas formas diferentes de análisis se pueden realizar, incluyendo electrofisiología, imágenes de calcio radiométrico, western blot, etc. ^{4, 5.}

Debido a la amplia gama de posibles aplicaciones para los sistemas de expresión heteróloga, muchos diferereactivos y productos nt se han desarrollado para utilizar estas células y sus cualidades ^6. Los sistemas de administración de ADN que se integran de forma transitoria o permanente de ADN extraño en células para estudiar la proteína exógena se ha convertido en una de las herramientas más populares y útiles para la investigación biológica. Más específicamente, transitoriamente la transfección de ADN en una célula se utiliza ampliamente como un proceso hacia delante simple, recta que requiere relativamente poco tiempo y materiales. Por otra parte, la tasa de éxito de las células que se someten a transfección es alta ^7. Esta técnica es muy fiable cuando se combina con un gen marcador tal como la proteína fluorescente verde (GFP), y se puede utilizar para muchas técnicas diferentes, tales como imágenes de calcio y electrofisiología ^5. Lamentablemente, sin embargo, que expresan transitoriamente el ADN en las células huésped viene con algunas de las dificultades principales, no en el menos que el nivel de expresión por célula no es fiable. El número de copias de ADN plásmido tomada up por célula es incontrolable, por lo tanto la expresión entre los experimentos individuales puede variar mucho ^2. Este problema se vuelve significativo cuando sea tratando de reproducir las condiciones fisiológicas, o la realización de las técnicas de recolección de datos precisos.

Como una solución a las complicaciones mencionadas anteriormente, los protocolos de transfección estables han sido diseñados en el que un gen de interés se puede insertar en el genoma de una célula bajo el estricto control de un promotor inducible, tal como un sistema de expresión represor de la tetraciclina, asegurando una sola de copias del plásmido se integra en el genoma de cada célula y sólo se expresa después de la inducción del mecanismo de la transcripción, por ejemplo, en presencia de doxiciclina. Aunque esto resuelve los obstáculos de los niveles de expresión de proteínas inconsistentes, este método pierde la comodidad de protocolo rápido y relativamente simple de transfecciones transitorias. El establecimiento de una línea celular estable que lleva por lo menos un par de semanas en which hay que calibrar una curva de muerte establecido por antibióticos específicos para mantener la expresión de la proteína y asegurar la integración del vector y hábilmente seleccionar y hacer crecer las colonias de células. En general, esto toma mucho más tiempo y esfuerzo con una menor tasa de éxito ^8.

A continuación, presentamos un protocolo intermedio que se basa en los puntos fuertes de las dos opciones de transfección populares para proporcionar una manera simple y eficaz para controlar los niveles de expresión en cualquier línea celular inducible. Mientras se mantiene células con un sistema de tet inducible, transitoriamente transfectar nuestro gen de interés, Transient Receptor canal catiónico miembro de la subfamilia V Potencial 1 (TRPV1), se ligó en un vector que se puede combinar de forma homóloga con el sistema de represor. De esta manera, el gen se puede introducir en las células sin empezar a expresar. Sólo con la adición de doxiciclina no el gen comienzan a expresar, lo que nos permite calibrar los niveles de proteína exprEssion según la técnica o niveles observados en condiciones fisiológicas. El protocolo también evita largas complicaciones asociadas con la generación de una línea celular que expresa de forma estable. Comenzamos mostrando los niveles cambiantes de la activación TRPV1 en imágenes de calcio desde un-inducida a través de cuatro horas de la inducción y la forma en que el aumento de los niveles de calcio intracelular se correlaciona. A continuación, duplicar el protocolo en toda la configuración de la celda de la técnica de patch clamp, que muestra la corriente aumenta con el tiempo de inducción en aumento. Por último, se presentan ejemplos de grabaciones de electrofisiología de un solo canal, y demostrar que esta técnica es especialmente útil para la expresión controlada en la búsqueda de la recopilación de datos precisos sobre la base de las unidades individuales de la proteína. A través de nuestro protocolo, ofrecemos una manera conveniente de controlar la expresión de proteínas en sistemas heterólogos, evitando las complicaciones de cultivo de células largas, proporcionando así una manera de controlar las condiciones entre los experimentos y proporcionar movolver a resultados reproducibles.

Protocol

1. ligando el gen de interés en el Sitio reprimible de Vector Obtener un vector inducible, como pcDNA5 / FRT / A o pcDNA4 / A. Analizar el gen de interés para cualquier sitio de restricción potencialmente susceptibles en el medio del gen que también aparecen en el sitio de clonación múltiple del vector elegido por el software de análisis de ADN silico 4. Uso de superposición estándar técnicas de PCR 4, flanquean el…

Representative Results

Para crear rápidamente un modelo de expresión inducible, hicimos uso de células HEK293 que expresan la proteína represora de tetraciclina (TR) (por ejemplo, T-Rex-293) y los vectores que contienen secuencias de operador de tetraciclina (TetO) entre el promotor CMV y el sitio de clonación múltiple (por ejemplo, pcDNA4 / TO). Cuando se transfectaron en células TREx-293, la expresión del gen de interés en pcDNA4 / TO se reprime, como TR se une a TetO. La adición …

Discussion

La transfección es un protocolo ampliamente utilizado para la expresión de la proteína y la investigación, con muchas variaciones diferentes para mejorar la consistencia y la estabilidad de expresión. reactivos de transfección transitoria ofrecen un simple, fácil de usar protocolo donde la célula y proteína de interés pueden ser analizados en cuestión de horas hasta toda la noche desde el momento de la transfección. Por desgracia, este enfoque puede ser impredecible cuando el modo de análisis requiere un ni…

Materials

pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler	Esco	n.a
Restriction Enzymes	ThermoScientific Fisher	ER0501
Agarose	Lonza	50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
NanoDrop 2000c	ThermoScientific Fisher	ND-2000C
T4 DNA Ligase	ThermoScientific Fisher	EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli	ThermoScientific Fisher	C404006
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Bio	A-301-5
Tryptone for microbiology	Merck	6.19305E+13
Yeast Extract	BD worldwide	212750
SIF6000R Incubated Shaker	LAB COMPANION	45H118
NucleoSpin®plasmid	Macherey Nagel	740588.25
MS 300V Power Supply	Major Science	MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System	ThermoScientific Fisher	B1A
T-REx™-293 cell line	Invitrogen	R710-07
DMEM (1X), liquid (high glucose)	Gibco	41965-039
HindIII-HF®	NEB	R3104S
ApaI	NEB	R0114S
CutSmart® Buffer	NEB	B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102520
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin	Gibco	10270106
HEPES Buffer Solution (1 M)	Biological Industries	03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)	Biological Industries	03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator	ThermoScientific Fisher	51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet	ThermoScientific Fisher	51025411
Blasticidine S hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER	Hausser Scientific	31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round	Knittel Glass	GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine	Corning	354210
Water, Cell Culture Grade	Biological Industries	03-055-1A
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Fura-2, AM ester	Biotium	BTM-50034
Pluronic® F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
µ-Slide 8 Well	ibidi	80826
(E)-Capsaicin	Tocris	462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope	Olympus	n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher	Sutter Instruments	n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera	QImaging	n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software	Molecular Devices	n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma-Aldrich	276855
P1000 micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
MF-900 Microforge	NARISHIGE	n.a
ValveBank perfusion sysytem	AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System	Molecular Devices	n.a
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	n.a
pCLAMP 10.6 Software	Molecular Devices	n.a
micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225