अमेरिकी Bullfrog का (राणा catesbeiana) sacculus बाल-सेल शरीर क्रिया विज्ञान के प्रत्यक्ष परीक्षा दे सकते हैं। यहाँ विच्छेदन और biophysical अध्ययन के लिए Bullfrog के sacculus की तैयारी में वर्णित है। हम इन बालों की कोशिकाओं से प्रतिनिधि प्रयोगों, एक बंडल के बल विस्थापन संबंध की गणना और उसके unforced गति की माप सहित दिखा।
सुनवाई और संतुलन के अध्ययन के मॉडल प्रणाली की biophysical अध्ययन से तैयार की अंतर्दृष्टि पर टिकी हुई है। ऐसा ही एक मॉडल, अमेरिकी Bullfrog की sacculus, श्रवण और vestibular अनुसंधान का एक मुख्य आधार बन गया है। इस अंग की पढ़ाई कैसे संवेदी कोशिकाओं बाल सक्रिय रूप से पर्यावरण से संकेतों का पता लगाने कर सकते हैं पता चला है। क्योंकि इन अध्ययनों के, अब हम बेहतर यांत्रिक gating और एक बाल सेल के पारगमन चैनलों, यांत्रिक रूपांतर में कैल्शियम की भूमिका के स्थानीयकरण, और बाल सेल धाराओं की पहचान को समझते हैं। यह अत्यधिक सुलभ अंग बालों की कोशिकाओं के कामकाज में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए जारी है। यहाँ हम अपने बालों की कोशिकाओं पर biophysical अध्ययन के लिए Bullfrog के sacculus की तैयारी का वर्णन है। हम पूरा विच्छेदन प्रक्रिया में शामिल हैं और विशिष्ट संदर्भों में sacculus की तैयारी के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम इसके अतिरिक्त की गणना सहित इस तैयारी का उपयोग प्रतिनिधि परिणामों में शामिलएक बाल बंडल के तात्कालिक बल विस्थापन संबंध और एक बंडल के सहज दोलन की माप।
स्तनधारियों की acousticolateralis अंगों एक जटिल संरचना के अधिकारी और एक संरचनात्मक आला कि उपयोग करने के लिए मुश्किल हो सकता है के भीतर झूठ बोलते हैं। उदाहरण के लिए, स्तनधारी कोक्लीअ एक चढ़ती भूलभुलैया शामिल हैं और मोटी अस्थायी हड्डी के भीतर एम्बेडेड है। कोक्लीअ के अलगाव अक्सर यह भीतर झूठ बोल संवेदी कोशिकाओं को यांत्रिक क्षति का कारण बनता है और इसलिए एक मुश्किल काम है 1 साबित हो गया है। Neuroscientists इस प्रकार सिस्टम जो और अधिक आसानी से कान के गर्भगृह से निकाले जाते हैं मॉडल के लिए खड़ा हो गया है।
इन मॉडल प्रणालियों में से एक है, अमेरिकी Bullfrog (राणा catesbeiana) की sacculus, दशकों श्रवण और vestibular प्रणाली के समारोह में generalizable अंतर्दृष्टि झुकेंगे के लिए है। sacculus दोनों कम आवृत्ति सुनवाई और भूकंपीय अनुभूति में संवेदी भूमिकाओं के साथ एक मिश्रित समारोह अंग है। sacculus का संवेदी कोशिकाओं को अपने बालों की कोशिकाओं, विशेष ट्रांसड्यूसर कि यांत्रिक ऊर्जा में परिवर्तित कर रहे हैंहमारे श्रवण और vestibular अंगों के भीतर विद्युत संकेतों में। प्रत्येक बाल सेल के शिखर सतह से पेश एक mechanosensitive बाल बंडल कि stereocilia बुलाया बढ़े microvilli के एक वर्गीकृत गुच्छा शामिल है। आसन्न stereocilia के सुझावों filamentous टिप-लिंक प्रोटीन से जुड़े रहते हैं कि यांत्रिक उत्तेजनाओं 2, 3 के जवाब में यंत्रवत् गेट आयन चैनल। हालांकि श्रवण और vestibular अंगों उत्तेजनाओं के विभिन्न प्रकार का जवाब है, वे एक आम का पता लगाने तंत्र का हिस्सा है। यह समानता कई अंतर्दृष्टि Bullfrog sacculus के अध्ययन के माध्यम से बाल-सेल mechanotransduction में प्राप्त की underlies। उदाहरण के लिए, बाल सेल के सक्रिय प्रक्रिया इस अंग 4, 5, 6, 7 में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, और बाल बंडल एक ऊर्जा लेने वाली प्रक्रिया को रोजगार यांत्रिक उत्पादन करने के लिएकाम। इतना ही नहीं यह दिखाया गया है कि बालों की कोशिकाओं सक्रिय काम 6 उत्पन्न है, लेकिन अलग-अलग सक्रिय प्रक्रिया अंतर्निहित तंत्र और एक बाल सेल की ट्यूनिंग विशेषताओं अंगों acousticolateralis Bullfrog के अध्ययन के माध्यम से अनावरण किया गया है। इन सक्रिय बाल बंडल गतिशीलता 8 और बाल सेल विद्युत अनुनाद 9, 10, sacculus में 11 और आवृत्ति चयनात्मकता उभयचर papilla में बाल सेल के रिबन अन्तर्ग्रथन 12 में शामिल हैं।
Bullfrog के sacculus कई कारणों के लिए संवेदी neuroscientists के लिए अपील की। स्तनधारी कोक्लीअ के विपरीत, इस अंग आसानी से सुलभ कान का कैप्सूल के भीतर निहित है। दूसरा, इस अंग के भीतर बालों की कोशिकाओं, 14 उपयुक्त परिस्थितियों 13 के तहत कई घंटे के लिए स्वस्थ रह सकते हैं। इस experimentat परमिटउनकी स्तनधारी समकक्षों के सापेक्ष लंबे समय से timescales पर इन कोशिकाओं पर आयन। तीसरा, अंग थोड़ा टेढ़ापन भालू, आसान हेरफेर की अनुमति है। चौथा, प्रत्येक अंग एक उच्च throughput और एक भी प्रयोग के लिए बालों की कोशिकाओं का एक उचित सेट लगाने का एक उच्च संभावना दोनों उपलब्ध कराने, एक हजार या उससे अधिक बालों की कोशिकाओं 15 शामिल हैं। अंत में, Bullfrog के sacculus आसानी से इस अंग और अपने बालों की कोशिकाओं के बड़े आकार का दुबलापन के कारण कल्पना की है।
इन गुणों के Bullfrog sacculus भीतर संवेदी कोशिकाओं के अध्ययन के लिए महान बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करते हैं। हाथ पर सवाल पर निर्भर करता है, कई प्रयोगात्मक तैयारियों में से एक sacculus से प्राप्त किया जा सकता है। इनमें से सबसे आसान एक चैम्बर तैयारी है। यहाँ sacculus कृत्रिम perilymph, एक सोडियम युक्त और उच्च कैल्शियम नमक से भरे एक कक्ष में स्थिर है। यह तैयारी बाल सेल धाराओं और बुनियादी बाल बंडल यांत्रिकी के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है। एक दूसरा विन्यास, दो कक्ष तैयारी, सहज बाल बंडल आंदोलनों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहां बालों की कोशिकाओं के शिखर की ओर एक पोटेशियम से भरपूर और कैल्शियम-गरीब खारा के संपर्क में है कृत्रिम endolymph करार दिया, जबकि basolateral ओर कृत्रिम perilymph में नहाया है। इन दो डिब्बों Salines के vivo व्यवस्था की नकल और एक वातावरण है कि बाल बंडलों अनायास दोलन करने की अनुमति देता है प्रदान करते हैं।
हम इस पत्र में अपनी संवेदी बालों की कोशिकाओं की biophysical अध्ययन के लिए Bullfrog के sacculus की तैयारी का वर्णन है। हम पहले मेंढक के भीतरी कान से इस अंग के अलगाव की एक विस्तृत चित्रण प्रदान करते हैं। हम तो दोनों एक और दो चैम्बर प्रयोगात्मक तैयारियों का वर्णन है और प्रत्येक विन्यास के लिए प्रतिनिधि परिणाम शामिल हैं।
Bullfrog के sacculus के भीतर कई हजार आसानी से सुलभ संवेदी बालों की कोशिकाओं झूठ बोलते हैं। यहाँ हम एक और दो चैम्बर रिकॉर्डिंग के लिए निष्कर्षण और sacculus की तैयारी प्रदर्शित करता है। इन दोनों की तैयारी बालों की कोशिकाओं और उनके संबद्ध बंडलों के दोनों micromechanical और electrophysiological अध्ययन की अनुमति है। क्योंकि ऊतक ऑक्सीजन युक्त नमक की लगातार प्रतिस्थापन के साथ कई घंटे के लिए जीवित रह सकते हैं, प्रयोगों लंबी अवधि के लिए जारी रख सकते हैं। इन तैयारियों में बालों की कोशिकाओं को आम तौर पर, विच्छेदन के बाद 6 घंटे के लिए microelectrode रिकॉर्डिंग के लिए सक्षम रहते हैं, जबकि बाल बंडलों अप करने के लिए 24 घंटे के लिए निकासी के बाद अनायास हिलाना।
सफल निष्कर्षण और sacculus के बढ़ते कई आम चुनौतियों surmounting पर टिका है। सबसे पहले, saccular मैक्युला के शिखर सतह के साथ सीधे संपर्क तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान बचा जाना चाहिए। saccular तंत्रिका सुरक्षित manipu के लिए एक सुविधाजनक संभाल प्रदान करता हैsacculus की आबादी। एक बार जब भीतरी कान अंगों के शेष से मुक्त कर दिया, sacculus एक बड़े बोर पिपेट का उपयोग कर शेष तरल पदार्थ में डूबे अपने संवेदी उपकला के लिए यांत्रिक क्षति से बचने के लिए, जबकि स्थानांतरित किया जाना चाहिए। धब्बेदार सतह से otoconia को हटाने के बालों की कोशिकाओं को यांत्रिक क्षति के बिना पूरा किया जाना चाहिए। क्योंकि otoconia मैक्युला के ऊपर सीधे झूठ, बालों की कोशिकाओं विच्छेदन उपकरण और otolithic झिल्ली otoconia हटाने के दौरान बीच आकस्मिक संपर्क द्वारा क्षतिग्रस्त किया जा सकता है। नुकसान से बचने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि otoconia का पतला जन मैक्युला से दूर एक स्थान पर आयोजित किया है और एक भी बड़े पैमाने पर हटाया जाना। यह कई समूहों, जिनमें से प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से निकाले होगा में otoconial जन के विखंडन से बचा जाता है। अगर otoconia के छोटे समूहों रहने के वे कोमल तरल पदार्थ एक पाश्चर विंदुक द्वारा दिया दबाव के साथ हटाया जा सकता है। एक अंतिम चुनौती में sacculus और एल्यूमीनियम बढ़ते वर्ग के बीच एक तंग सील का गठन शामिल हैदो कक्ष तैयारी। एक वेध काफी छोटा बारे में 100 माइक्रोन sacculus और आसपास के एल्यूमीनियम परमिट के ऊतकों की पूरी सील के बीच की अनुमति देने के लिए ओवरलैप के साथ एक वर्ग को रोजगार। गोंद के क्रम में एक तंग सील फार्म में लगभग 100 माइक्रोन मैक्युला की परिधि के चारों ओर saccular ऊतक के साथ संपर्क में लाया जाना चाहिए।
मुक्त सीए की एकाग्रता 2 + बालों की कोशिकाओं के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण विचार है। सीए 2 दोनों तेज और धीमी गति अनुकूलन को नियंत्रित करता है, इस प्रकार सहज बंडल प्रस्ताव 8, 23 सहित mechanotransduction तंत्र के कैनेटीक्स और बाल बंडल के सक्रिय प्रक्रिया घटना की विशेषताओं का निर्धारण। विवो में अन्त: कर्णोदकीय कैल्शियम, 250 सुक्ष्ममापी पर मौजूद है इसलिए सबसे physiologically प्रासंगिक कैनेटीक्स इस एकाग्रता (Maunsell JHR, आर याकूब, और ए जे Hudspeth पर मूल्यांकन कर रहे हैं। UnpublisHed टिप्पणियों 16)। हालांकि, बालों की कोशिकाओं से microelectrode रिकॉर्डिंग एक बाहरी कैल्शियम एकाग्रता microelectrode चारों ओर सेलुलर झिल्ली के समुचित सील के लिए 2 मिमी से अधिक की आवश्यकता है। यह इन प्रयोगों के लिए एक उच्च कैल्शियम खारा का उपयोग करने के लिए इसलिए जरूरी है। अंत में, एक कैल्शियम की सांद्रता की एक किस्म का उपयोग mechanotransduction पर बाहरी कैल्शियम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इच्छा हो सकती है। इन मामलों में, यह आम तौर पर टिप-लिंक टूटना और पारगमन 28 के अपरिवर्तनीय नुकसान के लिए नेतृत्व 1 माइक्रोन से नीचे है कि कैल्शियम की सांद्रता याद रखना महत्वपूर्ण है।
दो प्रयोगात्मक यहाँ वर्णित की तैयारी बालों की कोशिकाओं पर biophysical माप की एक श्रृंखला के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, अतिरिक्त माप इन तैयारियों को मामूली संशोधनों के साथ बनाया जा सकता है। मुड़ा हुआ saccular तैयारी में, बाल बंडलों laterally कल्पना कर रहे हैं। इमेजिंग इस सुविधाजनक मोरचा से बाल-बंडल गति सुसंगत चुटकुला का पता चलता हैदोनों छोटी और लंबा stereocilia 29 के आयन। यहाँ saccular मैक्युला पहले उसके अंतर्निहित ऊतकों से अलग किया जाता है और बाद में अक्ष saccular तंत्रिका कि इस तरह के बाल बंडलों बाहर का सामना करना और क्रीज पर laterally कल्पना कर रहे हैं द्वारा परिभाषित साथ मुड़ा। एक दूसरा संशोधन, बाल-सेल हदबंदी, दोनों बाल सेल के बंडल और उसके सोमा के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है। बालों की कोशिकाओं यंत्रवत् इमेजिंग और electrophysiological रिकॉर्डिंग 30 के लिए एक गिलास स्लाइड पर अलग कर रहे हैं। अंत में, बालों की कोशिकाओं के लिए एक समान हदबंदी प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, लेकिन यांत्रिक हदबंदी कदम के बिना उपकला से निकाला जा सकता है। बालों की कोशिकाओं है कि धीरे-धीरे उपकला से बाहर निकालना, electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए basolateral पहुँच प्रदान करते हुए यांत्रिक क्षति को कम करने में यह उपचार का परिणाम है। इन तैयारियों और उनके कई संशोधनों biophysical के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में मेंढक sacculus की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शनसंवेदी बालों की कोशिकाओं का अध्ययन।
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to acknowledge Dr. A. J. Hudspeth for funding and expertise in developing the preparations described in this paper. We also wish to thank Brian Fabella for creating and maintaining much of the custom equipment and software used in this protocol.
J. B. A. is supported by grant F30DC014215, J. D. S. is supported by grant F30DC013468, and both J. B. A. and J. D. S. are supported by grant T32GM07739 from the National Institutes of Health.
Common to both preparations | |||
Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
35 mm Petri dish (x2-3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For one-chamber preparation | |||
Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For two-chamber preparation | |||
Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
Mounting block | Supplementary file 3 | ||
Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Saline components | |||
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Parts lists for home-made equipment | |||
Solenoid puller | |||
Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Magnetic pins | |||
Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Open-top magnetic chamber | |||
Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |