Den amerikanske Bullfrog-tallet (Rana catesbeiana) sacculus tillater direkte undersøkelse av hår-cellefysiologi. Her disseksjon og forberedelse av Bullfrog er sacculus for biofysiske studier er beskrevet. Vi viser representative eksperimenter fra disse hårcellene, herunder beregning av en bunt styrke-fortrengning forhold og måling av sin utvungen bevegelse.
Studiet av hørsel og balanse hviler på innsikt trukket fra biofysiske studier av modellsystemer. En slik modell, sacculus av den amerikanske Bullfrog, har blitt en bærebjelke i auditiv og vestibular forskning. Studier av dette organ har avslørt hvor sanseceller hår aktivt kan detektere signaler fra omgivelsene. På grunn av disse studiene, har vi nå bedre forstå den mekaniske gating og lokalisering av et hår cellens transduksjon kanaler, kalsium rolle i mekanisk tilpasning, og identiteten til håret celle strømninger. Denne svært tilgjengelig organ fortsetter å gi innsikt i arbeidet i hårcellene. Her beskriver vi utarbeidelsen av Bullfrog er sacculus for biofysiske studier på sine hårcellene. Vi inkluderer den fullstendige disseksjon fremgangsmåte og tilveiebringe spesifikke protokoller for fremstilling av den sacculus i bestemte sammenhenger. Vi i tillegg omfatte representative resultater ved hjelp av dette preparatet, herunder beregning aven hårbunt største momentane kraftforskyvningsforhold, og måling av en bunt spontane oscillasjon.
De acousticolateralis organer av pattedyr har en kompleks arkitektur og ligger innenfor en anatomisk nisje som kan være vanskelig å få tilgang. For eksempel omfatter pattedyr cochlea en spiral labyrint og er integrert i den tykke tinningbenet. Isolering av sneglehuset forårsaker ofte mekanisk skade på sanseceller som ligger innenfor den og har derfor vist seg å være en vanskelig oppgave 1. Nevrologer har dermed snudd til å modellere systemer som er lettere hentet fra sanctum av øret.
En av disse modellsystemer, den sacculus av den amerikanske Bullfrog (Rana catesbeiana), har i flere tiår gitt generaliseres innsikt i funksjon av auditive og vestibulærsystemet. Den sacculus er en blandet funksjon organ med sanse roller i både lavfrekvent hørsel og seismikk sensasjon. Sansecellene i sacculus er dens hårceller, spesialiserte transdusere som konverterer mekanisk energitil elektriske signaler innenfor våre auditive og vestibulære organer. Prosjektering fra den apikale overflaten av hvert hår celle er en mechanosensitive hår pakke som består av en gradert dusk av forstørret microvilli kalt stereocilia. Spissen av tilstøtende stereocilia er innbyrdes forbundet ved trådformede spiss-link proteiner som mekanisk port ionekanaler som respons på mekanisk stimuli 2, 3. Selv om det auditive og vestibular organer svare på forskjellige typer stimuli, de deler en felles deteksjonsmekanisme. Dette alminnelighet ligger til grunn for de mange innsikter fått inn hår-celle mechanotransduction gjennom studier av Bullfrog sacculus. For eksempel har hår cellens aktive prosess blitt studert inngående for dette organ 4, 5, 6, 7, og hårbunten anvender en energikrevende prosess for å produsere mekaniskarbeid. Ikke bare har det vist seg at hårcellene genererer aktivt arbeid 6, men forskjellige mekanismene bak aktiv prosess og et hår cellens tuning egenskaper har blitt avduket gjennom studier av Bullfrog acousticolateralis organer. Disse inkluderer aktiv hår-bunt motilitet 8 og hårcelle elektrisk resonans 9, 10, 11 i sacculus og frekvens selektivitet på håret cellens bånd synapse 12 i den amfibier papilla.
Den Bullfrog er sacculus appellerer til sensoriske nevrologer for mange grunner. I motsetning til pattedyr cochlea, ligger denne organ i lett tilgjengelig otic kapsel. For det andre kan hårcellene i dette organet forbli sunn i flere timer under egnede forhold 13, 14. Dette tillater experimentation på disse cellene over lange tidsskalaer i forhold til sine pattedyr kolleger. Tredje, bærer organ lite kurvatur, tillater enkel manipulasjon. For det fjerde omfatter hvert organ tusen eller flere hårceller 15, noe som gir både en høy kapasitet og en høy sannsynlighet for å finne et passende sett av hårceller for et gitt eksperiment. Til slutt blir den bullfrog s sacculus lett visualiseres på grunn av tynnheten av dette organ og store størrelsen av dens hårcellene.
Disse egenskapene gir stor allsidighet for studiet av sansecellene i Bullfrog er sacculus. Avhengig av spørsmålet på hånden, kan en av flere eksperimentelle preparater fås fra sacculus. Den enkleste av disse er det en kammeret preparat. Her sacculus er immobilisert i et kammer fylt med kunstig perilymph, en natrium-rik og høy kalsiumsaltløsning. Dette preparatet gjør studiet av håret celle strømmer og grunnleggende hår bundle mekanikk. En andre konfigurasjon, to-kammer preparat, kan brukes til å studere spontane hårbunten bevegelser. Her den apikale side av hårceller er utsatt for en kalium-rik og kalsium-fattig saltvann betegnet kunstig endolymph, mens basolateral side er badet i kunstig perilymph. Disse to kamre etterligne in vivo arrangement av salines og tilveiebringe et miljø som gjør at hårbunter å oscillere spontant.
Vi beskriver i denne artikkelen utarbeidelsen av Bullfrog er sacculus for biofysiske studie av sensoriske hårceller. Vi gir først en detaljert skildring av isolering av dette organet fra frosken indre øret. Vi beskriver deretter både en- og to-kammer eksperimentelle forberedelser og inkluderer representative resultater for hver konfigurasjon.
Innenfor Bullfrog er sacculus ligge flere tusen lett tilgjengelige sensoriske hårceller. Her viser vi utvinning og forberedelse av sacculus for en- og to-kammer opptak. Disse to preparater tillate både mikromekaniske og elektrofysiologiske studier av hårceller og tilhørende bunter. På grunn av at vev kan overleve i flere timer med hyppig utskifting av oksygenert saltvann, kan eksperimenter fortsette i lang varighet. Hårcellene i disse preparatene vanligvis være levedyktig i microelectrode opptak i opptil 6 timer etter disseksjon, mens hårbunter oscillere spontant i opptil 24 timer etter ekstraksjon.
Vellykket utvinning og montering av sacculus hengsler på surmounting flere felles utfordringer. Først bør direkte kontakt med den apikale overflate av saccular makula unngås hele fremstillingsprosedyren. Den saccular nerve gir en praktisk håndtak for sikker manipuning av sacculus. Når frigjort fra resten av den indre øret organer, bør sacculus overføres ved hjelp av en stor boring pipette mens resten neddykket i væske for å unngå mekanisk skade på sin sensorisk epitel. Fjerning av otoconia fra macula overflaten må være fullført uten mekanisk skade på hårcellene. Fordi otoconia ligge rett oppå makula, kan hårcellene bli skadet av utilsiktet kontakt mellom disseksjon verktøy og otolithic membranen mens du fjerner otoconia. For å unngå skader, anbefaler vi at den geléaktige massen av otoconia bli holdt på et sted langt fra makula og fjernes som en enkelt masse. Dette unngår fragmentering av otoconial massen til en rekke grupper, som hver kan være individuelt utvinnes. Hvis små klynger av otoconia forblir de kan fjernes med en forsiktig fluidtrykk som leveres av en Pasteur pipette. En siste utfordring innebærer dannelsen av en tett forsegling mellom sacculus og aluminium montering torg itokammer-preparat. Anvendelse av en firkant med en perforering liten nok til å tillate overlapping på omtrent 100 um mellom sacculus og de omkringliggende aluminiums tillater fullstendig forsegling av vevet. Limet bør bringes i kontakt med omtrent 100 um av saccular vevet rundt makula sin omkrets for å danne en tett forsegling.
Konsentrasjonen av fri Ca 2+ er en viktig faktor i studiet av hårceller. Ca 2 + regulerer både hurtig og langsom tilpasning, og dermed bestemme kinetikken til mechanotransduction anordningen og egenskapene til hårbunten aktive-prosess fenomener, inkludert spontan bevegelse bunt 8, 23. Endolymfatiske kalsium in vivo er tilstede på 250 mikrometer, derfor de fysiologisk relevant kinetikk er vurdert til denne konsentrasjonen (Maunsell JHR, R. Jacobs, og AJ Hudspeth. UnpublisHed observasjoner 16). Men microelectrode opptak fra hårcellene krever en ekstern kalsiumkonsentrasjonen overstiger 2 mm for riktig tetting av cellemembranen rundt microelectrode. Det er derfor viktig å benytte en høy kalsiumsaltoppløsning for disse eksperimentene. Endelig kan man ønsker å studere effektene av ekstern kalsium ved mechanotransduction hjelp av en rekke kalsiumkonsentrasjoner. I disse tilfellene er det viktig å huske at kalsium konsentrasjoner under 1 mikrometer vanligvis føre til tip-link brudd og irreversibelt tap av transduksjon 28.
De to eksperimentelle forberedelsene beskrevet her gi rom for en rekke biofysiske målinger på hårcellene. Imidlertid kan flere målinger tas med små modifikasjoner til disse preparatene. I foldet saccular forberedelse, er hår bunter visualisert sidelengs. Imaging hår-bundle bevegelse fra dette utsiktspunktet avslører sammenhengende motion av både korte og høye stereocilia 29. Her saccular makula først skilt fra sin underliggende vev og deretter brettet langs aksen definert av saccular nerve slik at hår bunter ansikt utad og er visualisert lateralt på bretten. En annen endring, hår-celle dissosiasjon, gjør studiet av både hår cellens bunt og dens soma. Hårcellene er mekanisk dissosiert på en glassplate for bildebehandling og elektrofysiologisk registrering 30. Endelig kan hårceller ekstruderes fra epitelet ved å følge en lignende dissosiasjon protokoll, men uten mekanisk dissosiasjon trinnet. Denne behandlingen resulterer i hårcellene som gradvis Extrude ut av epitel, som gir basolateral tilgang for elektrofysiologiske opptak mens mekaniske skader minimeres. Disse preparatene og deres mange modifikasjoner demonstrere allsidigheten frosken sacculus som modellsystem for biofysiskestudie av sensoriske hårceller.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to acknowledge Dr. A. J. Hudspeth for funding and expertise in developing the preparations described in this paper. We also wish to thank Brian Fabella for creating and maintaining much of the custom equipment and software used in this protocol.
J. B. A. is supported by grant F30DC014215, J. D. S. is supported by grant F30DC013468, and both J. B. A. and J. D. S. are supported by grant T32GM07739 from the National Institutes of Health.
Common to both preparations | |||
Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
35 mm Petri dish (x2-3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For one-chamber preparation | |||
Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For two-chamber preparation | |||
Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
Mounting block | Supplementary file 3 | ||
Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Saline components | |||
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Parts lists for home-made equipment | |||
Solenoid puller | |||
Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Magnetic pins | |||
Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Open-top magnetic chamber | |||
Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |