אנגיוגנזה להמחיש באמצעות מיקרוסקופ Multiphoton Vivo ב מהונדסים גנטית לגרדום 3D-PLGA/nHAp Calvarial תיקון פגם קריטי של העצם
Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להמחיש כלי דם היווצרות ויוו ואת בזמן אמת ב- 3D פיגומים על ידי מיקרוסקופ multiphoton. אנגיוגנזה פיגומים מהונדסים נחקרה מודל פגם מאתר calvarial עצם קריטי. עוד כלי דם חדשים התגלו בקבוצה טיפול יותר שולטת.
Abstract
השחזור של העצם בגודל אנושות פגמים נשאר בעיה קלינית חמורה בגלל אנגיוגנזה המסכן בתוך רקמות מהונדסים פיגומים במהלך תיקון, אשר מעורר חוסר אספקת דם מספיקה וגורם נמק של רקמות חדשות. Vascularization מהירה היא תנאי חיוני הישרדות רקמות חדשות ושילוב עם רקמות הפונדקאי הקיים. הדור דה נובו של להערכת ב פיגומים הוא אחד הצעדים החשובים ביותר ביצירת התחדשות העצם יעיל יותר, ומאפשר תיקון רקמת לגדול לתוך לפיגום. כדי להתמודד עם בעיה זו, שינוי גנטי של לפיגום biomaterial משמש כדי להאיץ אנגיוגנזה ואת פרכת. עם זאת, להמחיש ומעקב ויוו היווצרות כלי דם בזמן אמת, פיגומים תלת מימדי (3D) או רקמת העצם החדש הוא עדיין מהווה מכשול עבור הנדסת רקמות העצם. מיקרוסקופ multiphoton (MPM) הוא הרומן מודאליות הדמיה זה יכול לרכוש נפחי נתונים מבנים ביולוגיים בצורה מינימלית פולשנית ברזולוציה גבוהה. מטרת מחקר זה הייתה להמחיש אנגיוגנזה עם מיקרוסקופ multiphoton ויוו ב לפיגום 3D-PLGA/nHAp מהונדסים לתיקון פגם calvarial עצם קריטי. PLGA/nHAp פיגומים היו functionalized לאספקת pdgf-b גורם גדילה גנים נושא וקטורים lentiviral (LV –pdgfb) כדי להקל על אנגיוגנזה וכדי לשפר את התחדשות העצם. ב מושתל לגרדום calvarial קריטי עצם פגם דגם העכבר, האזורים כלי דם (BVAs) ב- PHp פיגומים היו גבוהות משמעותית יותר ב- PH פיגומים. בנוסף, הביטוי של pdgf-b ו גנים הקשורים אנגיוגנזה, vWF , VEGFR2, גדל בהתאמה. ניתוח MicroCT ציינו כי היווצרות העצם החדש בקבוצה PHp השתפרו באופן דרמטי לעומת קבוצות אחרות. ידיעתנו זו הפעם הראשונה מיקרוסקופ multiphoton היה בשימוש רקמת העצם-הנדסה לחקור אנגיוגנזה 3D לגרדום ביו-מתכלים ויוו , בזמן אמת.
Introduction
העצם היא רקמה vascularized מאוד שממשיך לשפץ במהלך החיים של הפרט1. התחדשות העצם מהירה ויעילה של עצם גדול פגמים הנובעים טראומה, יתאחה, כריתות גידולים או מומים ואסטתיים היא תהליך פיזיולוגי מורכב. גישות טיפוליות המסורתי המשמש לתיקון פגם העצם כוללים בשתל, להשתלת ההשתלה, אך השימוש בהם כרוך במספר בעיות, מגבלות, כגון זמינות מוגבלת, תורם משמעותי באתר תחלואה, סיכון גבוה לזיהום, ו לארח הדחייה החיסונית2,3. עם זאת, שתלי עצם מלאכותית להציע חלופה יעילה כדי להקל על מגבלות אלה. הם יכול להתבצע מחומרים מתכלים, קל יהיה להמציא עם גודל הנקבוביות מתאימים, יכולים להיות מהונדסים4,5.
כיום, יש כבר מועסקים פיגומים הנדסת רקמות שונות בפיתוח של רקמות מהונדסים עצם6,7. כדי לגרום העצם תיקון והתחדשות ביעילות רבה יותר, biomaterials מהונדסים בשילוב עם גורמי גדילה יש בקע, השיגו תוצאות טובות8,9. למרבה הצער, מחצית חיים קצר, קל שלעולם לא פעילות ו supraphysiological במינון של גורמי גדילה על יעילות טיפולית להגביל יישום קליני שלהם10. כדי להתגבר על בעיות אלה, הוכח את המשלוח של גורם גדילה גנים במקום גורמי גדילה כמו גישה יעילה לקיים אתריים לטיפול של פגמים osseous ומחלות11,12. וקטורים ויראלי הם מבטיחים מסירה כלים עבור התחדשות רקמות עקב שלהם גבוהה לבטא יעילות13.
בין גורמי הגדילה גורם גידול נגזר טסית דם (PDGF-BB) נבחר במחקר זה כי זה לא רק של mitogen, chemoattractant עבור תאים mesenchymal ו- osteogenic, אך גם מעורר אנגיוגנזה14,15 . מחקרים קודמים קליניות הראו כי PDGF-BB יכולים בבטחה וביעילות לקדם את עצם תיקון פגמים osseous חניכיים16,17. מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי PDGF-BB מעוררת אנגיוגנזה המניע תא אנדותל ההגירה והתפשטות ויוו18,19. יתר על כן, PDGF-BB יכול גם לדקלם גזע mesenchymal (MSCs) מסוגל להבדיל לתוך תאי אנדותל20, ואת זה מדגיש עוד יותר את התפקיד הפוטנציאלי של MSCs כורוידאלית. לכן, וגורם להיווצרות דה נובו להערכת ב פיגומים עם PDGF-BB הוא צעד חשוב עבור התיקון של רקמות התפתחה פיגומים בהנדסת רקמות העצם.
עצם פגם הריפוי הוא תהליך morphogenetic רקמות דינמי הדורש פרכת מתואמת של אנגיוגנזה עמדות תיקון21. Neoangiogenesis לתוך פיגומים רקמות מהונדסים מושתל הוא דרישה מוקדמת חיוני לאספקת תאים עם חומרים מזינים וחמצן וצמיחה של הישרדות ועל הסרת פסולת מטבולית. בשימוש נפוץ שיטות הדמיה, כולל צילום רנטגן מיקרו-שחושב טומוגרפיה (microCT), דימות תהודה מגנטית (MRI), סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM), טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר) ו לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ, מוחלים במקום בבדיקה היסטולוגית להשיג אנגיוגנזה מידע22,23. עם זאת, שיטות אלה בפני מכשולים שונים להמחיש, מדידה neovasculature ב 3D פיגומים בהנדסת רקמות העצם. מיקרוסקופ multiphoton (MPM) היא טכניקת הדמיה יחסית הרומן כי יש יתרון מובהק בו זמנית להמחיש תאים, מטריצה חוץ-תאית, וסביב רשתות כלי דם ויוו. הוא בעל יכולת הדמיה תלת מימדי הטבועה של רקמות עמוק חדירה וגורם נזקי נמוכה. לפיכך, בעשור האחרון, MPM צברה הרבה תשומת לב ב מחקרים ביו24, לרבות מדעי המוח, אימונולוגיה ודינמיקה תאי גזע. עם זאת, הוא בקושי משמש במחקר אורטופדי.
Protocol
Representative Results
Discussion
העצם היא רקמה vascularized מאוד עם קיבולת ייחודי ללא הרף להחלים ולהתאושש לשפץ לאורך כל חייו של הפרט1. הרמה של vascularization חשוב פרכת ותיקון פגם. Vascularization נמוכה מגבילה את יישום קליני רחב של רקמות מהונדסים עצם. בניית עצם רקמות מהונדסים מאוד vascularized לפי תורת ביומימטיקה הפך להיות כלי לתיקון פ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי התוכנית טווס שנג’ן, סין (לא 110811003586331), שנג’ן התוכנית מחקר בסיסי (מס ‘ JCYJ20150401150223631, מס JCYJ20150401145529020, מס JCYJ20160331190714896), גואנג-דונג הציבורית מחקר ובניית יכולת התוכנית המיוחדת (מספר 2015A020212030), הקרן הלאומית למדע הטבעי של סין (מספר 81501893), התוכנית מחקר בסיסי מייג’ור הלאומי של סין (2013CB945503), ו האירוע מתקיים תוכנית חדשנות לחוקרים צעירים מצוינים (Y5G010).
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
References
- Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
- Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
- Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
- Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
- Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
- Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
- Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
- Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
- Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
- Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
- Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
- Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
- Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
- Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
- Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
- Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
- Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
- Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
- Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
- Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
- Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
- Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
- Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
- Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
- Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
- Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
- Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
- Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
- Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
- Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4 (2015).
- Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
- Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
- Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
- Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
- Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
- Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).
