Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para visualizar la formación de vasos sanguíneos en vivo y en tiempo real en 3D andamios por microscopía multifotón. Angiogénesis en andamios modificados genéticamente fue estudiada en un modelo de defecto murino hueso calvarial de crítica. Más nuevos vasos sanguíneos fueron detectados en el grupo de tratamiento que en los controles.
Abstract
La reconstrucción de defectos óseos de tamaño crítico sigue siendo un grave problema clínico debido a la pobre angiogénesis dentro tejido-dirigida andamios durante la reparación, que da lugar a una falta de suficiente riego sanguíneo y provoca la necrosis de los tejidos nuevos. Rápida vascularización es un requisito vital para la supervivencia de tejidos nuevos e integración con el existente tejido anfitrión. La generación de novo de vasculatura en andamios es uno de los pasos más importantes en la fabricación más eficiente, lo que permite reparar el tejido que crece en un andamio de la regeneración ósea. Para abordar este problema, la modificación genética de un andamio de biomaterial se utiliza para acelerar la angiogénesis y osteogénesis. Sin embargo, visualización y seguimiento en vivo formación de vasos sanguíneos en tiempo real y en tres dimensiones (3D) andamios o nuevo tejido óseo sigue siendo un obstáculo para la ingeniería de tejido óseo. Microscopía multifotón (MPM) es una modalidad de proyección de imagen de bio novela que puede adquirir datos volumétricos de estructuras biológicas de forma mínimamente invasiva y alta resolución. El objetivo de este estudio fue visualizar la angiogénesis con microscopía multifotón en vivo en un andamio de 3D-PLGA/nHAp genéticamente modificado para la reparación del defecto hueso calvarial crítica. Andamios PLGA/nHAp fueron funcionalizados para la entrega sostenida de un gen de factor de crecimiento pdgf-b con vectores lentivirales (LV –pdgfb) para facilitar la angiogénesis y a mejorar la regeneración ósea. En un hueso calvarial de crítico implantado andamio defecto modelo de ratón, las áreas de vasos sanguíneos (BVAs) en PHp andamios fueron significativamente mayores que en PH andamios. Además, la expresión de pdgf-b y genes relacionados con la angiogénesis, vWF y VEGFR2, aumentado correspondientemente. MicroCT análisis indicó que la nueva formación de hueso en el grupo de PHp mejorada dramáticamente en comparación con los otros grupos. A nuestro conocimiento, esta es la primera vez microscopía multifotón fue utilizado en ingeniería del tejido fino del hueso para investigar la angiogénesis en un andamio biodegradable 3D en vivo y en tiempo real.
Introduction
El hueso es un tejido altamente vascularizado que continúa para remodelar durante la vida de un individuo1. La regeneración ósea rápida y eficaz de los defectos de hueso grande como resultado de trauma, no sindical, resecciones tumorales o malformaciones craneofaciales es un proceso fisiológico complejo. Enfoques terapéuticos tradicionales utilizados para la reparación del defecto óseo incluyen implantación de autoinjerto y aloinjerto, pero su uso implica varios problemas y limitaciones, tales como la disponibilidad limitada, morbosidad del sitio donante importante, un alto riesgo de infección, y la sede de rechazo inmune2,3. Sin embargo, injertos óseos artificiales ofrecen una alternativa eficiente para paliar estas limitaciones. Pueden ser hechos de materiales biodegradables, son fáciles de fabricar con un tamaño de poro adecuado y pueden ser modificados genéticamente4,5.
En la actualidad, se han empleado varios andamios de ingeniería de tejidos en el desarrollo de la ingeniería de tejido óseo6,7. Para inducir la regeneración y reparación óseas más eficazmente, Biomateriales Ingeniería combinadas con factores de crecimiento han surgido y logra buenos resultados8,9. Por desgracia, la vida media corta, fácil perder actividad y dosis supraphysiological de factores de crecimiento para la eficacia terapéutica limitan su uso clínico10. Para superar estos problemas, la entrega de genes del factor de crecimiento en lugar de factores de crecimiento se ha demostrado como un enfoque eficaz para mantener la actividad biológica para el tratamiento de defectos oseos y enfermedades11,12. Vectores virales son prometedor entrega herramientas para la regeneración de los tejidos debido a su alta expresando eficiencia13.
Entre los factores de crecimiento, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) fue seleccionado en este estudio porque es un mitógeno y chemoattractant para las células mesenquimales y osteogénicos, sino un estimulante de la angiogénesis14,15 . Anteriores estudios clínicos y preclínicos demostraron que PDGF-BB podría con seguridad y efectivamente promover la reparación ósea en defectos oseos periodontales16,17. Estudios recientes revelaron que el PDGF-BB estimula angiogénesis por motivar la célula endotelial proliferación y la migración en vivo18,19. Además, PDGF-BB puede también hacer que las células madre mesenquimales (MSCs) capaces de diferenciarse en células endoteliales20y este destaca más el papel potencial de MSCs en neovascularización. Por lo tanto, inducir la formación de novo de vasculatura en andamios con PDGF-BB es un paso importante para la reparación de tejido crecido en andamios en ingeniería del tejido fino del hueso.
Defecto de hueso curativo es un proceso morfogenético de tejido dinámico que requiere osteogénesis coordinada y angiogénesis en la reparación de posiciones21. Neoangiogénesis en andamios de ingeniería de tejido implantados es un requisito previo esencial para el suministro de células con nutrientes y oxígeno para el crecimiento y la supervivencia y para la eliminación de desechos metabólicos. Utilizan métodos de la proyección de imagen, incluyendo rayos x micro-computarizada tomografía (microCT), la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI), microscopía electrónica (SEM), tomografía de coherencia óptica (OCT) y el láser confocal de la microscopia, la exploración se aplican en lugar de examinación histológica para obtener angiogénesis información22,23. Sin embargo, estos métodos enfrentan a diversos obstáculos en la visualización y medición occidentalización en andamios 3D en ingeniería del tejido fino del hueso. Microscopía multifotón (MPM) es una técnica de bio-proyección de imagen relativamente nueva que tiene la clara ventaja de simultáneamente visualizar células, matriz extracelular y redes vasculares en vivo. Posee una capacidad inherente de proyección de imagen tridimensional para la penetración de tejido profundo y provoca fotodaño baja. Por lo tanto, en la última década, el MPM ha ganado mucha atención en estudios biomédicos24, incluyendo en neurociencias, la inmunología y la dinámica de la célula de vástago. Sin embargo, apenas se utiliza en la investigación ortopédica.
Protocol
Representative Results
Discussion
El hueso es un tejido altamente vascularizado con una capacidad única para curar continuamente y remodelación a lo largo de la vida de un individuo1. El nivel de vascularización es importante para la reparación de osteogénesis y defecto. Baja vascularización limita la aplicación clínica amplio de ingeniería de tejido óseo. Construyendo un hueso altamente vascularizado tejido diseñado según la teoría de la biomimética, se ha convertido en una herramienta para la reparación de defecto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el programa de pavo real de Shenzhen, China (Nº 110811003586331), el programa de investigación básica de Shenzhen (no. JCYJ20150401150223631, no. JCYJ20150401145529020 y no. JCYJ20160331190714896), el Guangdong pública de investigación y desarrollo de capacidades programa especial (Nº 2015A020212030), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Nº 81501893), el programa nacional mayor Basic Research de China (2013CB945503) y la Programa de innovación de SIAT para excelentes investigadores jóvenes (Y5G010).
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
References
- Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
- Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
- Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
- Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
- Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
- Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
- Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
- Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
- Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
- Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
- Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
- Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
- Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
- Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
- Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
- Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
- Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
- Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
- Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
- Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
- Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
- Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
- Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
- Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
- Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
- Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
- Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
- Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
- Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
- Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4 (2015).
- Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
- Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
- Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
- Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
- Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
- Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).
