Angiogenez Multiphoton mikroskobu In Vivo genetiği değiştirilmiş 3D-PLGA/nHAp İskele tarafından grefti kritik Kemik defekti tamir için görselleştirme
Summary
Burada, damar oluşumu içinde vivo görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve gerçek zamanlı olarak 3D İskele tarafından multiphoton mikroskobu. Genetiği değiştirilmiş iskele anjiogenez bir fare grefti kritik Kemik defekti modelinde incelenmiştir. Daha fazla yeni kan damarları tedavi grubunda denetimlerde tespit edildi.
Abstract
Eleştirel ölçekli kemik defektleri yeniden inşası ciddi bir klinik sorun doku Mühendisliği iskele içinde zavallı angiogenez nedeniyle artış yeterli kan akımı eksikliği için verir ve yeni doku nekrozu neden olan onarım sırasında kalır. Hızlı vaskülarizasyon yeni doku hayatta kalma ve varolan ana bilgisayar doku ile tümleştirme için hayati bir önkoşuldur. İskele damarlara de novo nesil kemik rejenerasyon daha verimli bir iskele büyümeye doku onarımı izin yapımında en önemli adımlardan biridir. Bu sorunu çözmek için bir biomaterial iskele genetik değişiklik anjiogenez ve osteogenesis hızlandırmak için kullanılır. Ancak, görselleştirme ve in vivo izleme damar oluşumu içinde gerçek-zaman ve üç boyutlu (3D) İskele veya yeni kemik dokusu hala kemik doku mühendisliği için bir engel olduğunu. Multiphoton mikroskobu (MPM) biyolojik yapıları hacimsel veri yüksek çözünürlüklü ve minimal invaziv bir şekilde elde edebilirsiniz roman bir biyo-görüntüleme yöntemi var. Bu çalışmanın amacı angiogenez multiphoton mikroskobu içinde vivo grefti kritik Kemik defekti tamir için genetik olarak değiştirilmiş bir 3D-PLGA/nHAp iskele ile görselleştirmek için yapıldı. PLGA/nHAp iskele angiogenez kolaylaştırmak amacıyla ve kemik rejenerasyon geliştirmek için lentiviral vektörler (LV –pdgfb) taşıyan bir büyüme faktörü pdgf-b gen sürekli teslimat için functionalized. Fare modeli bir iskele implante grefti kritik kemik içinde defekt, PHp iskele kan damarı alanlarında (BVAs) PH iskele önemli ölçüde daha yüksekti. Buna ek olarak, ifade pdgf-b ve anjiogenezi ilgili genler, vWF ve VEGFR2, buna bağlı olarak arttı. MicroCT analiz yeni kemik oluşumu önemli ölçüde geliştirmek PHp grubunda diğer gruplar karşılaştırıldığında belirtti. Bilgimizi, bu multiphoton mikroskobu angiogenez 3D biyolojik degradable iskele vivo içinde ve gerçek zamanlı olarak araştırmak için kemik doku mühendisliğinde kullanılan ilk seferim.
Introduction
Kemik bir bireysel1kullanım süresi boyunca yeni model devam ediyor son derece bozukluklarına bir dokudur. Büyük kemik defektleri kaynaklanan travma, sendikasız, tümör rezeksiyonu veya Fasiyal malformasyonlar hızlı ve etkin kemik rejenerasyon fizyolojik karmaşık bir süreçtir. Kemik defekti tamir için kullanılan geleneksel tedavi yaklaşımları otogrefti ve homogreft implantasyon içerir, ancak bunların kullanımı birkaç sorunları ve sınırlı kullanılabilirlik, önemli donör sitesi morbidite, enfeksiyon, yüksek riski gibi sınırlamalar içerir ve bağışıklık ret2,3ev sahipliği. Ancak, yapay Kemik Greftler bu kısıtlamaları hafifletmek için etkili bir alternatif sunuyor. Onlar biyolojik olarak parçalanabilen malzemelerden yapılmış, uygun gözenek boyutu ile olmak imal etmek kolaydır ve genetiği değiştirilmiş4,5olabilir.
Şu anda, çeşitli doku Mühendisliği iskele kemik doku Mühendisliği6,7gelişiminde istihdam edilmiştir. Kemik onarım ve rejenerasyon daha etkili bir şekilde ikna etmek için tasarlanmış Biyomalzeme büyüme faktörleri ile birlikte ortaya çıktı ve iyi sonuçlar8,9elde. Ne yazık ki, kısa yarılanma, kaybetmek kolay aktivite ve büyüme faktörleri terapötik etkinlik için doz supraphysiological kendi klinik uygulama10sınırlayın. Bu sorunların üstesinden gelmek için büyüme faktörü genler büyüme faktörleri yerine teslim bioactivity kemik defektleri ve hastalıkları11,12tedavisi için sürdürebilmek için etkili bir yaklaşım olarak kanıtlanmıştır. Viral vektörleridir umut verici teslim nedeniyle verimliliği13ifade onların yüksek doku rejenerasyonu için araçlar.
Çünkü bu sadece bir mitojenle ve chemoattractant Mezenkimal ve Osteojenik hücreler için aynı zamanda bir uyarıcı angiogenez14,15 büyüme faktörleri arasında trombosit-türevi büyüme faktörü (PDGF-BB) Bu çalışmada seçildi . Önceki preklinik ve klinik çalışmalarda PDGF-BB güvenli ve etkili kemik onarım periodontal kemik defektleri16,17teşvik gösterdi. Son yıllarda yapılan çalışmalarda PDGF-BB motive edici endotel hücre göç ve nükleer silahların yayılmasına karşı vivo içinde18,19tarafından angiogenez uyarır saptandı. Ayrıca, PDGF-BB de Mezenkimal Kök hücre (MSCs) endotel hücreleri20ve daha fazla bu vurguları potansiyel rolü MSCs neovaskülarizasyon ayırt yeteneğine işleyebilir. Bu nedenle, damarlara iskele PDGF-BB ile de novo oluşumu inducing iskele kemik doku Mühendisliği büyüdü doku onarımı için önemli bir adım.
Kemik defekti şifa koordine osteogenesis ve anjiogenezi tamir pozisyonlar21gerektiren bir dinamik doku morfogenetik bir süreçtir. Neoangiogenesis içine yerleştirilmiş doku Mühendisliği iskele hücrelere besin ve oksijen gelişim ve hayatta kalma ve metabolik atık ile temini için gerekli bir önceden gerekli olduğunu. Yaygın olarak kullanılan görüntüleme yöntemleri, x-ışını dahil olmak üzere mikro tomografi (microCT), manyetik rezonans görüntüleme (MRG), tarama elektron mikroskobu (SEM), optik Koherens tomografi (OCT) ve confocal lazer mikroskobu, tarama yerine uygulanan hesaplanan Histolojik inceleme angiogenez bilgi22,23elde etmek için. Ancak, bu yöntemleri görselleştirme ve kemik doku Mühendisliği 3D iskele neovasculature ölçme çeşitli engellerle. Multiphoton mikroskobu (MPM) aynı anda hücreler, hücre dışı Matriks, görselleştirme ve damar ağları çevreleyen farklı avantajı vardır nispeten yeni bir biyo-görüntüleme tekniği olduğunu içinde vivo. Bu derin doku penetrasyon için doğal bir üç boyutlu görüntüleme özelliği sahip ve düşük duyarlilik neden olur. Bu nedenle, son on yılda çok ilgi gibi biyomedikal araştırmalar neuroscience, İmmünoloji ve kök hücre dinamiği dahil24, MPM kazanmıştır. Ancak, bu zar zor ortopedik araştırmalarında kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kemik sürekli iyileştirmek ve bir bireysel1ömür boyu yeni model için benzersiz bir kapasite ile son derece bozukluklarına bir dokudur. Vaskülarizasyon düzeyini osteogenesis ve arıza onarım için önemlidir. Düşük vaskülarizasyon kemik doku Mühendisliği geniş klinik uygulama sınırlar. Son derece bozukluklarına doku Mühendisliği kemik Biyomimetik teorisine göre inşa büyük kesimi kemik kusurları onarmak için bir araç haline gelmiştir. İskele çeşitli nispeten küçük …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada Shenzhen tavus kuşu Program tarafından Çin (No. 110811003586331), Shenzhen temel araştırma programı (No desteklenmiştir JCYJ20150401150223631, No. JCYJ20150401145529020 ve No JCYJ20160331190714896), Guangdong ortak araştırma ve kapasite geliştirme özel Program (No. 2015A020212030), Çin (No. 81501893) Ulusal Doğa Bilimleri temeli, Çin (2013CB945503), ulusal Major Basic araştırma programı ve Mükemmel genç araştırmacılar (Y5G010) için SIAT yenilik Program.
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
References
- Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
- Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
- Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
- Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
- Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
- Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
- Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
- Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
- Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
- Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
- Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
- Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
- Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
- Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
- Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
- Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
- Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
- Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
- Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
- Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
- Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
- Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
- Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
- Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
- Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
- Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
- Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
- Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
- Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
- Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4 (2015).
- Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
- Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
- Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
- Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
- Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
- Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).
