Introduction
A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência e afeta cerca de 35 milhões de pessoas em todo o mundo 1. As características neuropatológicas da doença que se acredita estar no cerne da AD patogênese são emaranhados neurofibrilares intracelulares de proteína tau hiperfosforilada 2 e placas extracelulares que consiste em (Ap) peptídeos 3 agregada beta-amilóide. Em consonância com isso, a avaliação da patologia de placa in vivo por biomarcadores foi recentemente incluída nos critérios diagnósticos para pesquisa em 4 dC. Para medições de CSF de Ap 1-42, vários imunoensaios estão disponíveis e são utilizados em muitos laboratórios clínicos 5. A concentração de Ap em CSF 1-42 é, aproximadamente, 50% mais baixa em pacientes com AD do que em pessoas idosas cognitivamente normais, reflectindo a deposição do péptido em placas na BRain 6, 7.
Esses biomarcadores são principalmente analisadas através de imunoensaios (isto é, técnicas à base de anticorpos), mas estes ensaios podem ser influenciadas por efeitos de matriz 8. O uso de imunoensaios em diferentes plataformas tecnológicas e a falta de ensaio padronização 9, 10 torna a introdução de concentrações de corte globais difíceis 11, 12. Um PGR analiticamente validado permitiria a calibração uniforme das diferentes plataformas de ensaio, de preferência, resultando em melhor comparabilidade entre plataformas analíticas e no melhor controle dos fatores que contribuem para a variabilidade global medição.
A quantificação absoluta de Ap 1-42 utilizando o método de LC-MS / MS desenvolvido supera muitos dos problemas associados com Techn à base de anticorpoiques. O método, listado como um PGR pelo Comité Misto de Rastreabilidade na Medicina Laboratorial (JCTLM banco de dados identificação do número C11RMP9), será utilizado para determinar a concentração absoluta de Ap 1-42 em um material de referência certificado (CRM) para harmonizar CSF Ap 1 -42 medições através de técnicas analíticas e plataformas. O fluxo de trabalho descrito deverá ser de relevância para o desenvolvimento de métodos de referência candidato para peptídeos e proteínas dentro de outras áreas da medicina.
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Protocol
NOTA: Este protocolo requer alíquotas de, pelo menos, 50 ul, com uma concentração de 50 ug / mL para cada péptido Ap, como material de partida. Os peptídeos Ap deve ser dissolvido em 20% de acetonitrilo (ACN) e solução concentrada de amoníaco a 4% em água desionizada (v / v) e armazenadas a 80 ° C.
Cuidado: Ver Tabela 1 para informações de segurança.
1. Preparação das soluções
- Preparação de 100 mL de 20% de ACN e 4% de solução concentrada de amoníaco em água desionizada (v / v) diluindo 20 mL de ACN e 4 mL de hidróxido de amónio concentrado (~ 25%) em água desionizada. Ajustar o volume final para 100 mL com água desionizada. Faça diariamente.
- Preparar 50 ml de 5 M de guanidina-hidrocloreto por dissolução de 26,08 g de cloridrato de guanidina-em água de s ionizada para um volume final de 50 mL. Loja a 20 ° C e fazer mensalmente fresco.
- Preparar 200 ml de ácido fosfórico a 4% em água desionizada (v /v) por diluição de 9,4 ml de ácido fosfórico concentrado (~ 85%) em água desionizada. Ajustar o volume final para 200 mL com água desionizada. Guarde na geladeira e fazer semanal fresco.
- Preparar 50 ml de 75% de ACN e 10% de solução de amoníaco concentrada (v / v) em água desionizada por diluição de 37,5 mL de ACN e 5 mL de hidróxido de amónio concentrado (~ 25%) em água desionizada. Ajustar o volume final para 50 mL com água desionizada. Faça diariamente.
- Descongelar, pelo menos, 2,5 mL de CSF humano para os calibradores, obtidos a partir de amostras de sobras identificou-de de análises clínicas de rotina.
- Prepare CSF artificial contendo Na 150 mM, 3,0 mM de K, Ca 1,4 mM, Mg 0,8 mM, 1,0 P, e Cl 155 mM em água desionizada e adicionar albumina de soro de bovino a uma concentração final de 4 mg / mL. Apenas 1 mL é necessária por análise, mas preparar um grande volume, alíquota e guarde para uso futuro.
2. Preparação dos calibradores
- Preparar 0,5 ml de 4 ug / ml 15 NAβ 1-42 por adição de 40 uL de 50 ug / ml 15 NAβ 142-0,46 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Misturar num misturador vortex durante 1 min.
- Preparar 2 mL de 100 ng / mL 15 NAβ 1-42 por adição de 50 uL da 4 ug / ml 15 NAβ 142-1,95 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrifugação de 2 ml. Misturar num misturador vortex durante 1 min.
- Prepare seis soluções de calibrador (FA) por mistura dos volumes de cada solução indicada na Tabela 2. Utilizar 0,5, 1,5, e 2 mL tubos de microcentrífuga. Misturar num misturador vortex durante 1 min.
- Prepare os calibradores finais (em duplicado) em tubos de microcentrífuga de 0,5 ml por adição de soluções de calibração correspondentes e CSF humano de acordo com a Tabela 3. Misturar num misturador vortex durante 1 min.
3. Preparação do padrão interno
- Preparar 2 mL de 0,8 ug / ml 13 CAβ 1-42 através da adição de 32 uL de 50 ug / ml 13 CAβ 142-1,968 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrifugação de 2 ml. Misturar num misturador vortex durante 1 min.
- Prepare 5 mL de 16 ng / ml 13 CAβ 1-42 por adição de 0,1 mL de 0,8 ug / mL a 4,9 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrífuga de 5 mL. Misturar num misturador vortex durante 1 min.
4. Preparação da Amostra Factor de Resposta
NOTA: O factor de resposta (RF) determinação é efectuada para determinar a concentração do péptido marcado utilizado para a calibração (15 NAβ 1-42). Isto requer que a concentração do péptido nativo Ap 1-42 foi determinado utilizando análise de aminoácidos (AAA). Assim, o volume e concentração de alíquotas de péptidos nativos Ap 1-42precisa para cumprir os requisitos da AAA.
- Prepare 0,5 mL de 4 ug / mL nativa (não marcado) Ap 1-42 por adição de 40 uL de 50 ug / mL de Ap nativo 1-42 para 0,46 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Misturar num misturador vortex durante 1 min.
- Prepara-se uma 2-ml 40 ng mistura / mL de nativo e 15 NAβ 1-42 por adição de 20 uL de 4 ug / mL de Ap nativo 1-42 e 20 uL de 4 ug / ml 15 NAβ 1-42 a 1,96 mL de 20% ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrifuga de 2 mL. Misturar num misturador vortex durante 1 min.
- Adicionar 20 ul da mistura de 40 ng / mL a 0,38 mL de CSF artificial num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Prepare duplicados e misturar num misturador vortex durante 1 min.
Preparação 5. Amostra
NOTA: Descongelar as amostras a serem medidas à temperatura ambiente num rolo.
- Adicionar 0,18 ml de cada calibrador, factor de resposta, e amostra desconhecida (incluindo o controlo de qualidade [QC] amostras, se usado) para uma placa de 96 de poços profundos 1 mL de proteína, de acordo com a Figura 1 (assumindo que uma placa completa é utilizada). Certifique-se adicionar as amostras em, ou perto, o fundo dos poços.
- Adicionar 20 ul de padrão interno a cada poço (ie, calibradores, factores de resposta, CQs, e desconhecidos); é crucial para libertar a gota no lado do poço perto da superfície da amostra, sem submergir a ponta da pipeta.
- Adicionar 0,2 mL de 5 M de guanidina-hidrocloreto a cada poço.
- Colocar a placa da amostra num agitador de microplacas e misturar as amostras durante 45 min a 1100 rpm. A frequência ideal pode variar de acordo com instrumentação. Definir a frequência e a amplitude do misturador de modo a que as soluções são misturadas cuidadosamente, e não há gotas de padrão interno ou CSF não misturados são deixados no lado dos poços.
- Adicionar 0,2 ml de ácido fosfórico a 4%a cada poço. Vortex misture rapidamente.
6. Extracção em Fase Sólida
NOTA: Em todos os de lavar, de carregamento, e passos de eluição, aplicar o mínimo possível de vácuo após a adição da solução e aumentar gradualmente conforme necessário para carregar ou eluir a solução. Desativar o vácuo entre cada carga e passo de eluição.
- Coloque uma bandeja reservatório de resíduos debaixo de um modo misto, de troca catiónica, 96 poços de extração em fase sólida (SPE) placa na câmara colector de placa de extracção.
- Sujeitar o sorvente SPE por adição de 0,2 ml de metanol a cada cavidade.
- Equilibrar a sorvente por adição de 0,2 ml de ácido fosfórico a 4% a cada poço.
- Transferir todas as amostras (cerca de 0,62 ml) em cada poço da placa de poços profundos para a placa de SPE. Usar uma pipeta de oito canais ao transferir as amostras a partir da placa de poços profundos para a placa de SPE; Não é crucial para transferir os volumes inteiros ou iguais de todas as amostras, desde que as amostras contêm um internoal padrão que irá compensar as variações.
- Lavar o sorvente depois de as amostras terem passado através através da adição de 0,2 ml de ácido fosfórico a 4% a cada poço.
- Após o solvente de lavagem foi eluído a partir do sorvente, substituir o tabuleiro de reservatório com uma placa de recolha ou câmaras de ar.
- Elui-se a amostra a partir do adsorvente por duas vezes a adição de 50 uL de 75% de ACN / 10% de amónia concentrada, e em atenção que esta solução exige um vácuo muito baixo ao passar através do sorvente. Lembre-se de desativar o vácuo entre cada adição.
- OPCIONAL: Selar a placa de coleção ou tubos e congelá-los a -80 ° C. Retire o selo da placa de recolha ou tubos antes de prosseguir para a etapa 6.8.2.
- Secam-se os eluatos por centrifugação usando vácuo (sem aplicação de calor); esta pode levar de uma a várias horas, dependendo da centrífuga de vácuo.
- Selar os recipientes e congelá-los a -80 ° C.
7. Líquido chromatography
- Preparar a fase móvel A (5% de ACN e 0,3% de amónia concentrada em água desionizada [v / v]), B (4% de água desionizada e 0,1% de amónia concentrada em ACN [v / v]), e lavagem da agulha (50% de ACN e 4% de amónia concentrada em água desionizada [v / v]).
- Para 500 ml de fase móvel A, adicionar 25 mL de ACN e 1,5 mL de amoníaco concentrado para água deionizada. Ajustar o volume final para 500 mL com água desionizada.
- Para 500 ml de fase móvel B, adicionar 500 mL de amónia concentrada e 25 ml de água desionizada para ACN. Ajustar o volume final para 500 mL com ACN.
- Preparar 250 mL de lavagem da agulha através da adição de 120 mL de ACN e 10 ml de amónia concentrada à água desionizada. Ajustar o volume final para 250 mL com água desionizada.
- Coloque a fase móvel A e B e garrafas de lavagem da agulha aberta num banho de ultra-sons durante 20 min antes da utilização com o sistema de CL
- Dissolve-se cada amostra com 25 ul de 20% ACN, e 4% Concentrasolução de amoníaco ted e colocá-los num agitador durante 20 min. Centrifugar-se as amostras e colocá-los no amostrador automático (mantenha a 7 ° C).
- Injecte 20 ul de amostra numa coluna monolítico 1 x 250 mm 2 de poliestireno-divinilbenzeno (de fase reversa) mantida a 50 ° C.
- Utilizar o gradiente LC mostrados na Tabela 4 com um caudal de 0,3 mL / min. Desviar os dois primeiros e os últimos cinco minutos para o lixo (pós-coluna), utilizando uma válvula de desvio para reduzir a contaminação do espectrômetro de massa.
Análise 8. Mass Espectrométrico
NOTA: Estes parâmetros foram utilizados para um espectrómetro de massa de quadrupolo híbrido-Orbitrap equipado com fonte de ionização electrospray aheated.
- Definir os parâmetros para a fonte de iões de acordo com a Tabela 5.
- Defina o instrumento MS para isolar os 4+ estados de carga de Ap nativo 1-42 (1,129.48 em massa-a carga rácio [m / z]), 15 1-42 NAβ (1,143.00 m / z), e 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) no analisador de massa de quadrupolo com uma largura de isolamento de 2,5 m / z.
- Fragmentar os peptídeos isolados na célula de colisão com uma energia de colisão normalizada (NCE) de 17,0. Este pode ter de ser ajustado para cada instrumento, mesmo do mesmo tipo (e especialmente se estiver usando outros tipos de instrumentos, tais como um triplo quadrupolo MS).
- Grave os espectros fragmento com uma resolução de 17.500, com uma meta de controle automático de ganho de 2 x 10 5 encargos e um tempo máximo de injecção de 250 ms.
9. Processamento de Dados
- Utilizar a soma dos iões dos produtos (com uma tolerância de ± massa de 250 unidades de massa mili [mmu)] na Tabela 6 para calcular as áreas de cromatografia para cada péptido. Note-se que os tipos de íons e números apenas são mostradas para Aâ nativa
- Determinar o factor de resposta média das duas amostras de factor de reacção dividindo a área sob a curva (pico cromatográfico) de 15 NAβ 1-42 com a área sob a curva de Ap nativo 1-42.
- Ajustar a concentração do NAβ 15 1-42 utilizado para calibração, multiplicando-se com o factor de resposta calculado no passo 9.2.
- Construir uma curva de calibração locando as razões das áreas de 15 NAβ 1-42 a 13 CAβ 1-42 dos dois conjuntos de calibradores contra a concentração.
- Calcular a inclinação e intercepção da curva de calibração por meio de regressão linear.
- Calcular a proporção de Ap nativo 1-42 área para o padrão interno (13 CAβ 1-42) para unamostras conhecidas.
- Extrapolar a concentração de amostras desconhecidas a partir da curva de calibração usando a inclinação e intercepção obtida no passo 9.5.
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Representative Results
A configuração da placa da Figura 1 é utilizada para um prato de amostras. Se menos amostras desconhecidas estão a ser analisado, o segundo calibrador, conjuntos de RF, e QC deve ser colocado após a primeira metade das amostras desconhecidas.
Como pode ser visto na Figura 2, os calibradores estão perto da linha de regressão, com baixo desvio padrão. Este método tem um nível mais baixo de quantificação de 150 pg / mL e um nível superior de quantificação de 4000 pg / mL. O desvio padrão residual da calibragem devem, evidentemente, ser tão baixa quanto possível. Se a calibração é não-linear, a execução deve ser descartado (dependendo da gravidade), e o desvio é mais provável devido à técnica de pipetagem incorrecto e / ou erros na diluição de calibradores. O coeficiente de variação (CV) de repetições deve ser inferior a 20%, mas de preferência abaixo de 10%.
ogether.within-page = "1"> O nativo de 15 N e 13 CAβ 1-42 saem da coluna LC simultaneamente (uma vez que eles só diferem no nível isotópica), com cerca de picos simétricos e sem tailing significativa (Figura 3 ). Pelo menos dez medições deve ser realizada para cada pico cromatográfico e pode ser ajustada com o tempo máximo de injecção no método do instrumento. Todos os três peptídeos podem ser medidas simultaneamente para todas as medições (calibração, RF, e incógnitas) durante a análise MS. No entanto, se a sensibilidade do método é sub-óptima, apenas os péptidos de interesse deve ser medido para cada injecção (isto é., Apenas medem 15 N e 13 CAβ 1-42 para calibradores, nativa e 15 NAβ 1-42 para amostras de RF, e nativa e 13 CAβ 1-42 de amostras desconhecidas).
Figura 1 "src =" / files / ftp_upload / 55386 / 55386fig1.jpg "/>
Figura 1: Layouts de placas SPE e profunda poços. disposição típica dos calibradores (AF), a amostra factor de resposta (RF), amostras de controlo de qualidade (QC), e desconhecidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curva de calibração. Curva de calibração construída utilizando 15 NAβ 1-42 a 172, 572, 1144, 2287, 3431, e 4574 pg / ml (ajustada usando o factor de resposta) e 13 CAβ 1-42 como padrão interno em CSF humano (n = 2) . A proporção de 15 NAβ 1-42 / 13 CAβ 1-42 área é representada graficamente (eixo dos Y)contra a concentração (eixo X). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cromatograma. Cromatograma de 0,500 ng / mL nativa (endógena) Aâ 1-42 (painel superior) e 1,6 ng / mL 13 CAβ 1-42 (painel inferior) em CSF humano. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Quantificação do desconhecido Ap 1-42 em amostras desconhecidas <./ forte> A razão da área do pico é calculada dividindo a área do pico Ap 1-42 cromatográfica nativo com o padrão interno (13 CAβ 1-42) área do pico cromatográfico. A concentração de Ap 1-42 nativo na amostra é extrapolada a partir da curva de calibração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Informações de segurança. Indicações de segurança para produtos químicos utilizados para este protocolo.
| solução calibrador | Volume de 100 ng / mL 15 NAβ 1-42 solução (ml) Volume de 20% de ACN & 4% de amoníaco (ml) | O volume final (ml) | Final 15 NAβ 1-42 concentração (ng / ml) | |
| UMA | 0.20 | 0,30 | 0.50 | 40,00 |
| B | 0,15 | 0,35 | 0.50 | 30.00 |
| C | 0.20 | 0.80 | 1.00 | 20,00 |
| D | 0,10 | 0,90 | 1.00 | 10.00 |
| E | 0,05 | 0,95 | 1.00 | 5.00 |
| F | 0,03 | 1,97 | 2,00 | 1,50 |
Tabela 2: soluções calibrador. soluções Calibrador preparado em 20% de ACN e 4% de amónia concentradausado para spiking calibradores CSF.
| calibrador | Volume de solução de calibrador correspondente (ml) | Volume de CSF humano (mL) | O volume final (ml) | Final 15N-Aβ1-42 concentração (ng / ml) |
| UMA | 0,02 (A) | 0,18 | 0.20 | 4.00 |
| B | 0,02 (B) | 0,18 | 0.20 | 3.00 |
| C | 0,02 (C) | 0,18 | 0.20 | 2,00 |
| D | 0,02 (D) | 0,18 | 0.20 | 1.00 |
| E | 0.02 (E) | 0,18 | 0.20 | 0.50 |
| F | 0,02 (F) | 0,18 | 0.20 | 0,15 |
Tabela 3: Os calibradores. Calibradores preparados no CSF humano.
| Tempo (min) | Fase móvel B% |
| 0 | 5 |
| 1 | 5 |
| 6 | 20 |
| 7 | 90 |
| 9 | 90 |
| 10 | 5 |
| 15 | 5 |
Tabela 4: gradiente de LC. O gradiente LC usado com uma taxa de fluxo constante de 300 mL / min.
| Parâmetro | Valor |
| gás de bainha | 50 |
| gás auxiliar | 6 |
| tensão de pulverização | 4.4 kV |
| S-lente de RF | 61 |
| temperatura do aquecedor | 190 ° C |
| temperatura capilar | 350 ° C |
Tabela 5: configurações de fonte de íons. Parâmetros para a fonte de íons para ser definido no software do instrumento afinado.
| ion precursor | íons de produtos |
| Native Aβ1-42 (m / z 1129,58, 4+) | 915,19 (+ b334), 943,21 (+ b344), 975,98 (+ b354), 1000,74 (+ b364), 1029,51 (+ b384), 1054,03 (b394 +), 1078,79 (B404 +), 1107,06 (B414 +), 1163,23 (B313 +), 1200,25 (b323 +), 1257,29 (b343 +), 1300,96 (b353 +), 1333,66 (b363 +), 1372,00 (b383 +), 1405,02 (b393 +) |
| 15N-Aβ1-42 (m / z 1143,00, 4+) | 926,41, 954,68, 987,95, 1.012,71, 1.041,22, 1.066,99, 1.091,75, 1.120,28, 1.177,18, 1.215,55, 1.272,58, 1.316,92, 1.349,94, 1.388,63, 1.422,31 |
| 13C-Aβ1-42 (m / z 1179,50, 4+) | 955,33, 985,11, 1.019,37, 1.045,14, 1.074,65, 1.100,67, 1.126,69, 1.156,40, 1.253,43, 1.313,14, 1.358,50, 1.393,19, 1.432,21, 1.466,90 |
Tabela 6: Os iões usados para quantificação. Os 4+ estados de carga dos iões precursoras são isolados no analisador de massa de quadrupolo, com uma largura de isolamento de 2,5 m / z. Os iões dos produtos (com uma tolerância de ± massa 250 mmu) são utilizadas para calcular as áreas de cromatografia para cada péptido. tipos e números de lítio são only mostradas para Aâ 1-42 iões de produtos nativos, uma vez que são os mesmos para ambos 15 NAβ 1-42 e 13 CAβ 1-42.
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Discussion
Para o método descrito, em vez de usar uma matriz substituta, foi utilizada a abordagem de substituição analito 13, 14, 15, 16, o que permite a calibração em CSF humano. A abordagem envolve duas analito substituto padrões marcados isotopicamente diferentes. Um (15 NAβ 142) é usado para gerar a curva de calibração em CSF humano, enquanto a outra (13 CAβ 142) é usado como padrão interno. Desconhecidos endógenos Ap 142 concentrações são então extrapolada a partir da curva de calibração construída usando o 15 NAβ 142/13 CAβ 142 rácio pela endógena Ap 142/13 CAβ relação de 142 calculado. A abordagem substância substituta foi usada, pois não há CSF livre de analito disponíveis, e baixa de Ap 142 recuperaçãofoi observada quando se usa nativa Ap 142 em uma matriz substituto durante o desenvolvimento do método.
Desde 15 NAβ 142 e de Ap nativo 142 pode dar respostas diferentes na MS, a concentração de 15 NAβ 142 é ajustada através da medição de um-uma amostra amostra de CSF artificial RF contendo concentrações iguais de 15 NAβ 142 e de Ap nativo 142, com uma concentração conhecida determinada por AAA.The factor de resposta pode ser diferente entre os diferentes espectrômetros de massa devido a possíveis variações na pureza isotópica do 15 péptido N-rotulados entre lotes. Assim, o fator de resposta devem ser determinados para cada dia de medição.
Os passos mais críticos neste protocolo são a preparação dos calibradores e as amostras de RF. Peptídeos Ap, especialmente Aâ 1-42, são muito hidrofóbico e facilmente ficar com pontas de pipeta umatubos nd superfícies 8, 17, 18. Para minimizar a perda de peptídeos Ap durante a pipetagem, é extremamente importante para saturar as pontas de pipeta antes do parto. De preferência, três volumes de solução de péptido devem ser eliminados antes da entrega de uma solução contendo novo tubo. Dependendo do volume e da concentração da solução-mãe, isto nem sempre é possível. A segunda melhor abordagem é, naturalmente, para pipetar a solução peptídica cima e para baixo três vezes antes da entrega. Pela mesma razão, é importante o uso de tamanhos apropriados para os tubos, evitando grandes volumes vazios.
Dados publicados anteriormente para o método mostram que a recuperação foi de 100% dentro (15%) 15. Os erros relativos para os calibradores foram calculados-back abaixo dos 15% de toda a gama definida pela curva de calibração 19.
Um obvious limitação desta técnica é que é de baixo rendimento em comparação com os imunoensaios automáticos. No entanto, o objectivo do método descrito é de alta precisão, e não o rendimento. Este método também pode ser expandido para incluir Ap 1-38 e 1- Ap 40, 19 que são mais curtos. Outra limitação deste método é que o operador terá extensa formação espectrometria de massa antes de executar a análise sobre o instrumento.
Quantificação utilizando imunoensaios está dependente da interacção entre o anticorpo e o antigénio. Esta interacção pode ser afectada pela presença de componentes de amostra que podem interferir ou competir com a interacção. Além disso, a interacção pode também ser afectada pela conformação do antigénio. Estes efeitos são difíceis de controlar e acredita-se ser a principal razão pela qual tem sido difícil harmonizar resultados entre plataformas de imunoensaio e entre laboratórios. Becquantificação AUtilize com MS baseia-se contando directamente as moléculas alvo em relação a um padrão estável, marcada com isótopos, quantificação absoluta e é geralmente afectada por tais efeitos de matriz. Além disso, as medições de proteínas de diagnóstico por imunoensaios deve ser apoiada por uma cadeia ininterrupta de procedimentos de medição de ordem superior e materiais, a partir validado LC-MS / MS e estáveis, padrões internos marcados com isótopos para RMP e CRM, melhorando assim a comparabilidade e fiabilidade dos resultados 20, 21.
Em conclusão, o PGR descrito para a medição de Ap 142 em CSF é um passo importante no desenvolvimento de um CRM que vai ajudar a estabelecer a concentração geral de corte para Aâ 142 em CSF. Exatas pontos de corte são muito importantes para diagnosticar com precisão AD cedo e são de extrema importância quando se novos tipos de drogas modificadoras da doença chegar à clínica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
| Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
| Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
| Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
| Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
| Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
| Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
| Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
| ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
| Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
| Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
| Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
| 13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
| Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |
References
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