To bildeanalysealgoritmer, "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" ble opprettet, for automatisk å kvantifisere ni morfologiske trekk ved Drosophila neuromuskulære (NMJ).
Synaptic morfologi er tett relatert til synaptisk effektivitet, og i mange tilfeller morfologiske synapse defekter til slutt føre til synaptisk funksjonsfeil. Drosophila larve neuromuskulær ledd (NMJ), en veletablert modell for glutamaterge synapser, er blitt grundig undersøkt i flere tiår. Identifikasjon av mutasjoner forårsaker NMJ morfologiske defekter avslørte et repertoar av gener som regulerer synapse utvikling og funksjon. Mange av disse ble identifisert i store studier som fokuserte på kvalitative metoder for å oppdage morfologiske abnormiteter i Drosophila NMJ. En ulempe med kvalitative analyser er at mange subtile spillere som bidrar til NMJ morfologi sannsynlig forbli ubemerket. Mens kvantitative analyser er nødvendige for å detektere de presise morfologiske forskjeller, er slike analyser er ikke ennå vanligvis utføres fordi de er arbeidskrevende. Denne protokollen beskriver i detalj to bildeanalysealgoritmer "Drosophila </em> NMJ Morphometrics" og 'Drosophila NMJ Bouton Morphometrics', tilgjengelig som Fiji-kompatible makroer, for kvantitativ, nøyaktig og objektiv morfometrisk analyse av Drosophila NMJ. Denne metodikken er utviklet for å analysere NMJ terminaler immunolabeled med de vanlig brukte markører Dlg-1 og . BRP tillegg, dens videre anvendelse til andre markører, slik som HRP, Csp og SYT er presentert i denne protokollen De makroer er i stand til å vurdere ni morfologiske NMJ egenskaper:. NMJ område, NMJ perimeter, antall boutons, NMJ lengde, NMJ lengste gren lengde, antall øyer, antall grener, antall forgreningspunkter og antall aktive soner i NMJ terminal.
Kognitive forstyrrelser såsom utviklingshemming, autisme spektrum lidelse og schizofreni er ofte kjennetegnet ved unormal synaptiske funksjon 1, 2, 3. Synapse morfologi og funksjon er tett sammenknyttet; morfologiske defekter kan føre til feilfunksjon synaptiske og, omvendt, vil avvikende synaptisk transmisjon påvirke synaptiske modning og morfologi 4, 5, 6.
Et antall modellorganismer har vært anvendt for å bedre forstå synapse biologi og belyse hvordan synaptiske endringer påvirker funksjoner i hjernen hos helse og sykdom 7, 8, 9. Drosophila NMJ er et grundig studert og vel-etablert in vivo-modell for glutamatergisk synapse biologi 10, 11. I de siste tiårene har denne modellen har blitt brukt for fysiologiske og gen-fokusert undersøkelser, såvel som for storskala genetiske skjermer, med sikte på å detektere morfologiske forskjeller mellom NMJs. Spesielt har termin genetiske skjermer identifisert mange viktige regulatorer og mekanismene bak synapse utvikling og funksjon 12, 13, 14, 15, 16. Men de fleste av disse skjermene støttet seg på visuell vurdering av NMJ terminal morfologi og på kvalitativ påvisning av de synaptiske abnormaliteter eller semi-kvantitativ bedømmelse av noen morfologiske egenskaper. Som en konsekvens er heller subtile synaptiske morfologiske avvik som er ikke-opplagt for det menneskelige øyet lett savnet. For å være i stand til å detektere omfattende kvantitative forskjeller, erNMJ må være nøyaktig evalueres ved systematisk kvantifisering av de morfologiske parametere av interesse. Måling NMJ funksjonene manuelt er arbeidskrevende, særlig når det er flere NMJ trekk av interesse og / eller ved utførelse av store genetiske screeninger. For å støtte multiparametrisk, high-throughput morfologisk analyse og for å oppnå målet kvantifisering ble to makroer "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" utviklet 17. Begge makroer kjøres i åpen kildekode bildeanalyse programvare Fiji 18, og kan kvantifisere både confocal og nonconfocal bilder.
"Drosophila NMJ Morphometrics" tiltak NMJ terminaler immunfarget med den postsynaptiske markør skiven stor-1 (Dlg-1) eller den presynaptiske pepperrot peroksidase (HRP), co-merket med den aktive sone markør bruchpilot (BRP). Det kvantifiserer ni morfologisk Parameters (nærmere beskrevet nedenfor): NMJ område, NMJ perimeter, antall boutons, NMJ lengde, NMJ lengste gren lengde, antall øyer, antall grener, antall forgreningspunkter og antall aktive soner i den synaptiske terminal (Figur 1) . Selv om en algoritme for å bestemme antallet av boutons er til stede i denne makroen, gjorde det ikke kravene til nøyaktighet 17. For å vurdere antall boutons på riktig måte, er det nødvendig å bruke "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" makro som er spesielt utviklet for å kvantifisere boutons ved hjelp NMJ preparater immunfarget med anti-Synaptotagmin (SYT) eller anti-Cystein streng protein (CSP), og co-immunolabeled med BRP. Den "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" makro kvantifiserer de følgende parametre: antall boutons, NMJ bouton område, NMJ lengde, NMJ lengste gren lengde, antall øyer, antall grener, antall forgreningspunkter og antall aktive zones (figur 2).
Makroene bestå av tre undermakroer: (I) "Konverter å stable" identifiserer alle tilgjengelige bildefiler og skaper Z-hyperstacks og maksimal intensitet projeksjoner av begge kanaler. Som utgang, vil denne makroen generere to nye filer per synapse kalt "stack_image_name" og "flatstack_image_name". II) "Definer roi" vil åpne alle maksimalprojeksjonsbildene "flatstack_image_name" etter hverandre, og presentere dem med anmodning om å definere området av interesse (ROI), hvor den spesifikke synaptiske terminal av interesse er til stede manuelt. Dette ble gjennomført for å tillate uttrekk av synapser kopling til tilstøtende muskler og / eller andre typer av synaptiske terminaler (for eksempel 1s) som kan være til stede i bildene 11. (III) "Analyse" gjelder fullt ut automatisert analyse for alle regioner av bildene innenfor grensene av avkastningen. Somet resultat av dette trinn, vil brukeren få to nye filer: "results.txt" hvor alle numeriske målingen skal bearbeides og et "res_image_name.tif" hvor underliggende bilde segmente som produseres av makro vil bli illustrert. Ved bildeanalyse tre strukturer er utledet fra hver synaptiske terminal: den NMJ disposisjon, den NMJ skjelett, og antallet BRP-positive aktive soner. Den NMJ omriss blir brukt til å bestemme den NMJ området og dets omkrets, og et påfølgende vannskille separasjon gir antall boutons. Fra skjelettet, blir fem NMJ funksjoner utledet: den totale NMJ lengde, idet summen av lengden av den lengste kontinuerlig bane som forbinder alle to endepunkter (lengste gren lengde), antallet ikke-bundne kamre pr NMJ (referert til som "øyer" ), antallet grener, og antallet forgreningspunkter (ett forgreningspunkt kobler tre eller flere grener). Antallet aktive soner bestemmes i BRP-kanal ved tellingBRP-positive flekker. Den kommenterte NMJ omriss (gul linje), den NMJ skjelett (blå linje), og antallet BRP-positive aktive soner (angitt med hvite foki) lagres i et resultater bilde og målingene av parameterne er behandlet til en (. txt) output file (figur 3).
Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" ble først beskrevet og i stor utstrekning validert av Nijhof et al., 17. Dette manuskriptet fokuserer på metoden for å analysere NMJ morfologi ved hjelp av makroene "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Ikke desto mindre, forut for makro-assistert analyse, NMJ disseksjoner og immunostainings må utføres. Dette er avgjørende skritt, og en kombinasjon av markører benyttes for immunhistokjemi må være egnet for makro analyser. Disse trinn er kort nevnt i og for segDette skjer 1 av denne protokoll og sende brukeren til referanser som beskriver i detalj de protokoller for å utføre disse fremgangsmåtene.
"Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ bouton Morphometrics" er kraftige verktøy for forskere som er interessert i å vurdere synapse morfologi. Manuell vurdering av NMJ parametre er arbeidskrevende; Det er anslått at makroene ville spare en erfaren forsker opp til 15 min / NMJ brukt på manuell bildesegmentering. Med en til to dusinvis av synapser evaluert per tilstand eller genotype, oppsummerer dette raskt opp til betydelige mengder spart tid, selv i små skala studier. Når man utfører store skjermer, gevinsten av å bruke høy gjennomstrømning analyse, sammenlignet med manuell vurdering og kvantifisering kan være enorm. I tillegg til øket gjennomstrømning, makroene gi lett objektiv analyse; de ekskluderer personlige fordommer som ellers krever blindet eksperimenter samt mellommenneskelige forskjeller som oppstår når flere forskere er involvert i analysen. Endelig makroene gir en følsom og nøyaktig enalysis av NMJ funksjoner, slik at identifisering av synaptiske regulatorer som forårsaker snarere subtil enn dramatiske NMJ defekter og har så langt holdt seg lite verdsatt av forskeren øye. Detaljert informasjon om validering prosedyrer og algoritmer som brukes i makroene finnes i publikasjonen Nijhof et al. 17.
Funksjonaliteten av makroene er validert for hensiktsmessig måle morfologiske trekk av Drosophila melanogaster NMJs ved muskel 4. Deretter ble det vist at makroene var også egnet for å analysere synapser på andre muskler i denne organisme. Det er sannsynlig at makroene kan også brukes til å måle morfologiske parametere av NMJ med lignende struktur i andre arter, inkludert andre Drosophila-arter og ytterligere insekter. Selv NMJs svært fjerne i utvikling, for eksempel, NMJs av musene, som viser en ganske lignende strukturell konformasjon 29. Makroene har ikke blitt testet på NMJ forberedelser fra andre arter, men potensielle brukere oppfordres til å teste makroer til slike formål.
Det er svært viktig at brukeren utforsker de forskjellige auto-terskler og algoritmer for å definere / velge de best egnede makroinnstillinger for bildene. Med disse innstillingene, er en nøyaktighet på ca 95% oppnås når makrovurdering ble sammenlignet med manuell evaluering. Justere makroinnstillinger til riktig segment 100% av bildene kan være en svært arbeidskrevende eller umulig prosedyre. Det anbefales derfor utelukkelse av bilder ikke riktig segmentert hvis deres tall er under 5%. Øyensynlig, hvis kvaliteten av bildene er lav, vil makroene generere høyere forhold på utilfredsstillende bilde segmentations. bilder lav kvalitet vil på samme måte påvirke manuell evaluering og kan derfor ikke være knyttet til utførelsen av makroene. Likevel makroene er ganske robuste som de var ment for bildes generert på et høyt innhold mikroskop (en automatisert fluorescens mikroskop som tillater avbildning av store antall prøver) 17.
Et kritisk punkt er at brukeren visuelt kontrollerer alle resultat bilder generert ved makroene. Dette vil tillate å oppdage og inkluderer bilder med utilfredsstillende segmentering. I kapittel 6 i denne protokoll, blir brukeren guidet hvordan å justere innstillingene for korrekt bilde segmentering når du kjører sub-makro "Analyze". Hvis du raskt kjent med kravene til makroer og hvordan du justerer makroinnstillinger en mappe som heter "Examples_adjusting makroinnstillinger" er inkludert i makro repository https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a. Tretten undermapper, hver med eksempler avbildninger som fremkommer ved forskjellige mikroskop plattformer (høyt innhold / konfokal / fluorescensmikroskoper) og forskjellige immunostainings, er gitt. En PDF tittelen “Eksempler guide” er inkludert i sammemappen hvor de nødvendige innstillingene for hvert eksempel er gitt, sammen med et tekstdokument som gir de forventede resultater og resultater bilder.
Makroene ble utviklet for å behandle bilder som er lagret som TIFF separerte filer, likevel enkelte brukere kan ha lagret bildene sine i et annet format. Følgende nettsted https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 inneholder en mappe som heter "Drosophila NMJ" der tre eksempelfiler (eksempel 1-3) og dokumentet "Eksempler Guide" med detaljerte instruksjoner hvordan du importerer bilder til makro om ikke lagret som TIFF-separerte filer kan også bli funnet i den samme mappen.
Sammen "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ bouton Morphometrics" makroer kvantifisere ti forskjellige NMJ funksjoner: NMJ området, NMJ omkrets, antall boutons, NMJ bouton området, NMJ lengde, NMJ lengste grenen lengde, antall islands, antall grener, antall forgreningspunkter og antall aktive soner. Dette gir en stor fordel over så langt tilgjengelige verktøy som kan vurdere bare ett eller noen få synaptiske funksjoner 30, 31. Multiparametrisk kvantitativ analyse bærer et stort potensial for nye funn, for eksempel, for å identifisere nye regulatorer som styrer en opp til mange aspekter av synapsen biologi. Det gir også den nødvendige oppløsning for å bestemme gener som coregulate nøyaktig de samme eller overlappende NMJ egenskaper og således er egnet til å operere i vanlige molekylære reaksjonsveier. Til slutt, åpnes det mulighet for å undersøke hvordan forskjellige parametre synaptiske korrelerer med hverandre i uforstyrrede betingelser 17 og som gener som sikrer slike koordinerte morfometriske korrelasjoner.
Til sammen illustrerer denne protokollen hvordan du bruker de to makroer "Drosophila NMJ Morphometrics" og"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", som utfører objektiv og følsom kvantifisering av ti morfologiske NMJ funksjoner i en high-throughput måte.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner Wien Drosophila Resource Center og Bloomington Drosophila lager senter (NIH P40OD018537) for å gi Drosophila stammer. Vi takker Jack Fransen fra mikroskopisk Imaging Center for kompetansestøtte i bildebehandling. Denne studien ble støttet av VIDI og topp tilskudd (917-96-346, 912-12-109) fra nederlandske organisasjonen for Scientific Research (NWO), av to DCN / Radboud University Medical Centre Stipendiater, av den tyske mental retardasjon Network finansiert av NGFN + program for den tyske føderale departementet for utdanning og forskning (BMBF) og av EUs FP7 storskala integrerte nettverks Gencodys (HELSE-241995) til AS. De organer hadde ingen rolle i studieutforming, datainnsamling og analyse, beslutning om å utgi, eller fremstillingen av manuskriptet.
Immunostainings | Dilution | ||
Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
Material | Company | Catalog number | Comments |
Equipment | |||
Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
Zeiss Axio imager | |||
Computer | Mac or Pc | ||
Material | Company | Catalog number | Comments |
Software | |||
FIJI |