الحضانة لفترات طويلة الحادة العصبية الأنسجة للالكهربية والكالسيوم التصوير
Summary
إزالة مرة واحدة من الجسم، والأنسجة العصبية تتأثر كثيرا الظروف البيئية، مما يؤدي إلى تدهور في نهاية المطاف من الأنسجة بعد 6-8 ساعة. باستخدام طريقة حضانة فريدة من نوعها، التي تراقب عن كثب وتنظم البيئة خارج الخلية من الأنسجة، وقابلية الأنسجة يمكن تمديدها بشكل ملحوظ ل> 24 ساعة.
Abstract
الحادة الاستعدادات الأنسجة العصبية، وشرائح المخ وwholemount في شبكية العين، وعادة ما يمكن أن تستمر إلا لل6-8 ساعة بعد تشريح. وهذا يحد من الوقت التجريبية، ويزيد من عدد الحيوانات التي تستخدم في الدراسة. هذا القيد على وجه التحديد الآثار بروتوكولات مثل التصوير الكالسيوم التي تتطلب فترات طويلة قبل الحضانة مع الأصباغ التطبيقية حمام. ويرتبط 4 ساعات بعد تشريح بإحكام مع انخفاض في صحة الأنسجة – نمو البكتيريا الأسي خلال 3. توضح هذه الدراسة وسيلة للحد من انتشار البكتيريا في الأعمال التحضيرية الحادة للحفاظ على الأنسجة العصبية قابلة للحياة لفترات طويلة من الزمن (> 24 ساعة) دون الحاجة للمضادات الحيوية، والإجراءات العقيمة، أو وسائل الإعلام زراعة الأنسجة التي تحتوي على عوامل النمو. عن طريق دورة السائل خارج الخلية من خلال الأشعة فوق البنفسجية والحفاظ على الأنسجة في غرفة مخصصة عقد في 15-16 درجة مئوية، تظهر الأنسجة لا فرق في الخصائص الكهربية، أو الاشتراكية الكالسيومgnaling من خلال الأصباغ الكالسيوم داخل الخلايا في> 24 ساعة postdissection. وهذه الطرق تمتد ليس فقط وقت تجريبي لتلك التي تستخدم الأنسجة العصبية الحادة، ولكن سوف يقلل من عدد الحيوانات اللازمة لاستكمال أهداف تجريبية، وسوف تحدد معيار الذهب للحضانة الأنسجة العصبية الحادة.
Introduction
الكهربية والتصوير وظيفي (الكالسيوم، والجهد الأصباغ الحساسة) وهما من التقنيات التجريبية الأكثر شيوعا في علم الأعصاب. الدماغ الاستعدادات شريحة وwholemount في شبكية العين، والتي سيتم مناقشتها هنا، وتوفير وسيلة لدراسة الخصائص الكهربية واتصال متشابك دون تلوث من التخدير أو مرخيات العضلات. شرائح الدماغ وشبكية العين wholemount حفاظ على السلامة الهيكلية، على عكس الثقافات أو الخليط خلية، والسماح للدراسة دوائر محددة وشبكات الدماغ 1. تسجيلات من الأنسجة المعزولة لها يتم استبعاد من المزايا أكثر في الجسم الحي التسجيلات الحركات المرتبطة ضربات القلب والتنفس. وعلاوة على ذلك، والتصور المباشر يسمح فئات معينة من الخلايا لتكون مستهدفة، والتطبيق المحلي للأدوات الدوائية 2 و 3.
تسجيلات التصحيح المشبك وأحسبالبوتاسيوم صبغ التحميل في wholemount الشبكية معقدة بسبب وجود الداخلية الحد من غشاء (ILM)، الذي يغطي طبقة الشبكية العقدة الخليوي (RGC) ويمنع الوصول المباشر إلى الخلايا. عادة، يتم كشط هذا الغشاء بعيدا مع ماصة الزجاج للسماح التطبيق المباشر للماصة التصحيح وتشكيل ختم gigaohm على خلية واحدة. وبالإضافة إلى ذلك، والأصباغ الكالسيوم تطبيقها حمام لا تعبر ILM وإما أن يتم حقنه تحت هذا الغشاء 4، نقل retrogradely حقن التالية في العصب البصري 5 أو electroporated من خلال الأنسجة 6. وعلاوة على ذلك، عندما تستخدم نموذجا القوارض من التهاب الشبكية الصباغي، الماوس الثالثة / الثالثة، وILM هو أكثر سمكا وأكثر من ذلك لا يمكن اختراقها. هنا، ونحن نستخدم تقنية لإزالة ILM مع الهضم الأنزيمي 7، للسماح كلا في كل مكان الكالسيوم صبغ التحميل، والوصول المباشر إلى خلايا الشبكية العقدة لrecordi التصحيح، المشبكخ ع 8.
تعتمد التسجيلات ناجحة سواء من شرائح الدماغ أو wholemount في شبكية العين على تشريح وحضانة الأنسجة العصبية قابلة للحياة. عادة، يتم استخراج الأنسجة صباح يوم التجربة والمحتضنة في الاصطناعي السائل النخاعي (ACSF) حتى يتم استخدامها للتسجيلات. عادة، لا تزال الأنسجة قابلة للحياة 6-8 ساعة، مع تدهور كبير بعد هذه النافذة الوقت. ومع ذلك، كل شرائح الدماغ والاستعدادات الشبكية wholemount عادة ما تنتج المزيد من الأنسجة مما يمكن تسجيله من ضمن هذه الفترة الزمنية القصيرة. ونتيجة لذلك، غالبا ما يتم تجاهل الأنسجة في نهاية اليوم واكتمال تشريح مرة أخرى في الأيام اللاحقة. وهذا يعني يستخدم حيوان آخر و~ 2 ساعة من الإعداد وتشريح / تلطيخ المتكررة. يصف بروتوكول التالية وسيلة لإطالة حياة بعض الأنسجة العصبية لأكثر من 24 ساعة، وهذا يعني عددا أقل من الحيوانات تستخدم، والمزيد من الوقت التجريبي هو متاح. الأنسجة الحيوية ثكما تقييمها من خلال تسجيل الخصائص الكهربية وديناميات الكالسيوم، وكانت هذه الخصائص لا يمكن تمييزه بين <4 ساعات و> 24 ساعة postdissection.
وتشير هذه النتائج التي هي خصائص خلية واحدة سليمة وظيفية بعد حضانة طويلة فحسب، بل نشاط الشبكة، وفقا لتقييم الكالسيوم التصوير والتسجيلات الكهربية، هو دون تغيير> 24 ساعة postdissection. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن الأصباغ الكالسيوم يمكن أن يبقى في الخلايا لفترات طويلة دون أن تسبب أي آثار ضارة. تطبيق هذا البروتوكول يوضح أن النشاط الوظيفي للخلايا العصبية في الأنسجة العصبية الحادة يمكن أن يستمر لفترات طويلة، وبمجرد درجة عالية من التنظيم والبيئة الخارجية. وعلاوة على ذلك، كما الجدوى الأنسجة تختلف اختلافا كبيرا بين المختبرات بسبب البروتوكولات حضانة مختلفة، يحدد هذا الأسلوب معيار الذهب للمعلمات المثالية التي يجب تطبيقها للحد من التباين في صحة نوي الحادالأنسجة رونالد.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة طريقة حضانة لتمديد بقاء الأنسجة العصبية الحادة للتصوير والكهربية التجارب، مما يؤدي إلى خفض أعداد الحيوانات اللازمة لاستكمال أهداف التجريبية. عمليتان رئيسيتان تحكم تدهور الأنسجة العصبية على مر الزمن: أ) زيادة مستويات البكتيريا، والزيادة المصاحبة ف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).
Materials
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device |
| Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Camera | Andor | Ixon + | |
| High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
References
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).
- Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
- Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
- Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396 (2014).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588 (2015).
- Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
- Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
- Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
- Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , (2015).
- Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
- Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
- Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
