Langdurige incubatie van Acute neuronaal weefsel voor elektrofysiologie en calcium-imaging
Summary
Na verwijdering uit het lichaam, is neuronaal weefsel sterk beïnvloed door omgevingsfactoren, waardoor eventuele degradatie van het weefsel na 6-8 uur. Met behulp van een unieke incubatie werkwijze, die nauw bewaakt en regelt de extracellulaire omgeving van het weefsel, kan levensvatbaarheid van het weefsel aanzienlijk worden verlengd> 24 uur.
Abstract
Acute voorbereidingen zenuwweefsel, de hersenen plakjes en netvlies wholemount, kan meestal alleen worden gehandhaafd voor 6-8 uur na dissectie. Dit beperkt de experimentele tijd en verhoogt het aantal dieren die worden gebruikt per studie. Deze beperking specifiek effect protocollen zoals calcium imaging dat langdurige voorincubatie met bad toegepaste kleurstoffen vereisen. Exponentiële bacteriegroei binnen 3-4 uur na het snijden stevig gecorreleerd met een afname van de gezondheid weefsel. Deze studie beschrijft een werkwijze voor het beperken van de verspreiding van bacteriën in acute preparaten levensvatbare neuronale weefsels gedurende lange perioden (> 24 uur) zonder de noodzaak voor antibiotica, steriele procedures of weefselcultuur medium dat groeifactoren handhaven. Op door het extracellulaire fluïdum door UV-bestraling en het houden van het weefsel in een aangepaste houdkamer bij 15-16 ° C, het weefsel vertoont geen verschil in elektrofysiologische eigenschappen of calcium signaling door middel van intracellulaire calcium kleurstoffen bij> 24 uur postdissection. Deze methoden zullen niet alleen experimentele tijd te verlengen voor de gebruikers van acute neuronaal weefsel, maar het aantal benodigde dieren experimentele doelen beslag neemt, en een gouden standaard voor acute neuronaal weefsel incubatie stellen.
Introduction
Elektrofysiologie en functionele beeldvorming (calcium, voltage gevoelige kleurstoffen) zijn twee van de meest gebruikte experimentele technieken in de neurowetenschappen. Brain slice voorbereidingen en netvlies wholemount, die hier zal worden behandeld, een middel van het onderzoeken van elektrofysiologische eigenschappen en synaptische connectiviteit zonder besmetting door verdoving of spierverslappers. Brain plakjes en retinale wholemount behouden hun structurele integriteit, in tegenstelling tot culturen of celhomogenaten, waardoor de studie van specifieke circuits en de hersenen netwerken 1. Opnames van geïsoleerde weefsel voordelen ten opzichte van in vivo opnames bewegingen in verband met de hartslag en de ademhaling worden geëlimineerd. Bovendien maakt directe visualisatie specifieke klassen van cellen worden gericht en lokale behandeling met farmacologische gereedschappen 2, 3.
Patch-clamp opnamen en calcium dye-loading in retinale wholemount wordt bemoeilijkt door het bestaan van de Inner beperken Membrane (ILM), die de retinale ganglioncellen (RGC) laag bedekt en voorkomt dat directe toegang tot de cellen. Typisch wordt dit membraan weggeschraapt met een glazen pipet om rechtstreekse toepassing van een patch pipet en de vorming van een gigaohm zegel op een enkele cel toe. Daarnaast hebben bad toegepast calcium kleurstoffen niet ILM overschrijden en moeten ofwel geïnjecteerd onder dit membraan 4, retrograad transport na injectie in de oogzenuw 5 geëlektroporeerde of door het weefsel 6. Bovendien, als het gebruik van een knaagdier model van retinitis pigmentosa, de rd / rd muis, het ILM is dikker en ondoordringbaar. Hier maken we gebruik van een techniek om de ILM te verwijderen met enzymatische afbraak 7, zowel alomtegenwoordige calcium dye-loading, en directe toegang tot retinale ganglion cellen voor patch-clamp recordi toestaanngs 8.
Succesvolle opname van ofwel hersencoupes of retinale wholemount afhankelijk dissectie en incubatie van levensvatbare neuronaal weefsel. Kenmerkend wordt weefsel geëxtraheerd op de ochtend van het experiment en geïncubeerd in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) totdat het wordt gebruikt voor opnamen. Gewoonlijk weefsel blijft nog gedurende 6-8 uur, met significante afbraak na deze tijdskader. Zowel hersencoupes en wholemount retina preparaten meestal bij meer dan weefsel kan worden opgenomen binnen deze korte periode. Daarom wordt vaak weefsel die aan het einde van de dag en de dissectie opnieuw voltooid op opeenvolgende dagen. Dit betekent dat een ander dier wordt benut en ~ 2 uur over de instellingen en dissectie / kleuring herhaald. Het volgende protocol beschrijft een werkwijze voor het verlengen van de levensduur van neuronaal weefsel voor meer dan 24 uur, wat betekent dat minder dieren worden gebruikt, en meer experimentele tijd beschikbaar. Levensvatbaarheid van het weefsel wzoals beoordeeld door middel van het opnemen van elektrofysiologische eigenschappen en calcium dynamiek, en deze eigenschappen waren niet te onderscheiden tussen <4 uur en> 24 uur postdissection.
Deze resultaten geven aan dat niet alleen eencellige eigenschappen intact en functioneel na verlengde incubatie, maar netwerkactiviteit, zoals beoordeeld door calcium-imaging en elektrofysiologische opnames, onveranderd> 24 uur postdissection. Bovendien tonen wij dat calcium kleurstoffen in cellen blijven gedurende langere tijd zonder enige nadelige effecten. De toepassing van dit protocol toont aan dat de functionele activiteit van neuronen in acute neuronaal weefsel kan worden gehandhaafd gedurende lange perioden, zodra de externe omgeving sterk gereguleerd. Zoals levensvatbaarheid van het weefsel varieert sterk tussen laboratoria door incubatie verschillende protocollen, deze methode wordt een gouden standaard voor het ideale parameters die moeten worden toegepast op de variabiliteit te verminderen in de gezondheid van acute neuRonal weefsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft een incubatie methode om de levensvatbaarheid van zenuwweefsel acute verlengen beeldvorming en elektrofysiologische experimenten, waarbij het aantal dieren nodig experimentele doelen voltooien verminderen. Twee belangrijke processen regelen de verslechtering van neuronaal weefsel in de tijd: i) verhoogde bacteriën niveaus, en de daarmee gepaard gaande toename van bacterieel endotoxine vrijgegeven, en ii) excitotoxiciteit die de traumatische snijden procedure 10 volgt. Als …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).
Materials
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device |
| Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Camera | Andor | Ixon + | |
| High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
References
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).
- Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
- Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
- Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396 (2014).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588 (2015).
- Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
- Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
- Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
- Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , (2015).
- Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
- Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
- Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
