L'incubation prolongée de aiguë Neuronal tissus pour électrophysiologie et Calcium-imagerie

Summary

Une fois sorti du corps, le tissu neuronal est fortement influencée par les conditions environnementales, ce qui conduit à une dégradation éventuelle du tissu après 6 à 8 heures. En utilisant une méthode d'incubation unique, qui surveille de près et régule l'environnement extracellulaire du tissu, la viabilité des tissus peut être considérablement prolongée pour> 24 h.

Abstract

Aiguë des préparations de tissus neuronaux, des tranches de cerveau et wholemount rétinienne, ne peuvent généralement être conservés pendant 6-8 heures après dissection. Cela limite la durée de l'essai, et augmente le nombre d'animaux qui sont utilisés pour l'étude. Cette limitation spécifiquement les impacts des protocoles tels que l'imagerie calcique qui nécessitent une pré-incubation prolongée avec des colorants de bain appliqués. la croissance bactérienne exponentielle dans les 3 – 4 h après le découpage en tranches est étroitement corrélée avec une diminution de la santé des tissus. Cette étude décrit un procédé pour limiter la prolifération des bactéries dans les préparations aiguës pour maintenir le tissu neuronal viables pendant des périodes de temps prolongées (> 24 h) sans avoir recours à des antibiotiques, des procédures stériles ou milieux de culture tissulaire contenant des facteurs de croissance. Par un cycle du fluide extracellulaire par irradiation UV et de maintenir le tissu dans une chambre de maintien de la commande à 15 – 16 ° C, le tissu ne montre aucune différence dans les propriétés électrophysiologiques, ou si de calciumgnaling par des colorants de calcium intracellulaire à> 24 h postdissection. Ces méthodes ne seront pas seulement prolonger le temps expérimental pour ceux qui utilisent le tissu neuronal aigu, mais permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation des objectifs expérimentaux, et établira une norme d'or pour l'incubation de tissu neuronal aiguë.

Introduction

Électrophysiologie et d'imagerie fonctionnelle (calcium, tension colorants sensibles) sont deux des techniques expérimentales les plus couramment utilisés dans les neurosciences. Casse des préparations de tranche et wholemount rétinienne, qui sera examiné ici, fournissent un moyen d'examiner les propriétés électrophysiologiques et la connectivité synaptique sans contamination par des anesthésiques ou des relaxants musculaires. Des tranches de cerveau et de la rétine wholemount conservent leur intégrité structurelle, à la différence des cultures ou des homogénats cellulaires, permettant l'étude des circuits spécifiques et des réseaux cérébraux ^1. Les enregistrements de tissu isolé présentent des avantages par rapport aux enregistrements in vivo que les mouvements associés au rythme cardiaque et la respiration sont éliminés. De plus, la visualisation directe permet à des classes spécifiques de cellules à cibler, et l' application locale d'outils pharmacologiques ^{2, 3.}

enregistrements de patch-clamp et calcium colorant chargement dans wholemount rétinienne est compliquée par l'existence de l'Inner Limitation de la membrane (ILM), qui couvre la couche rétinienne Ganglion cellulaire (RGC) et empêche l'accès direct aux cellules. Typiquement, cette membrane est gratté avec une pipette en verre pour permettre une application directe d'une pipette de patch et la formation d'un joint d'étanchéité gigaohm sur une seule cellule. En outre, les colorants de calcium bain appliquée ne traversent pas la ILM et doivent soit être injectés sous cette membrane ^4, rétrogressivement transporté après l' injection au niveau du nerf optique ⁵ ou électroporation à travers le tissu ^6. En outre, lorsqu'on utilise un modèle de rongeur de la rétinite pigmentaire, le rd / rd souris, la MLI est plus épaisse et plus impénétrable. Ici, nous utilisons une technique pour éliminer l'ILM à la digestion enzymatique ^7, pour permettre à la fois du calcium omniprésent colorant chargement, et un accès direct à des cellules ganglionnaires de la rétine pour patch-clamp recordings ^8.

enregistrements réussis provenant soit des tranches de cerveau ou wholemount rétinienne dépendent de la dissection et l'incubation du tissu neuronal viable. Typiquement, le tissu est extrait le matin de l'expérience et mis en incubation dans le liquide céphalorachidien artificiel (aCSF) jusqu'à ce qu'il soit utilisé pour l'enregistrement. En général, le tissu reste viable pour les 6 – 8 h, à une dégradation importante qui suit cette fenêtre temporelle. Cependant, les deux tranches de cerveau et les préparations de rétines wholemount produisent habituellement plus de tissu que peuvent être enregistrées à partir de cette courte période de temps. Par conséquent, le tissu est souvent mis au rebut à la fin de la journée et de la dissection est achevée à nouveau les jours suivants. Cela signifie un autre animal est utilisé et ~ 2 h de la configuration et la dissection / coloration répétée. Le protocole suivant décrit une méthode pour prolonger la vie de tissu neuronal pendant plus de 24 h, ce qui signifie moins d'animaux sont utilisés, et le temps plus expérimental est disponible. Tissue viabilité wcomme évalué par l'enregistrement des propriétés électrophysiologiques et la dynamique de calcium, et ces propriétés ne se distinguaient pas entre <4 h et> 24 h postdissection.

Ces résultats indiquent que non seulement les propriétés des cellules individuelles intactes et fonctionnelles après une incubation prolongée, mais l'activité du réseau, tel qu'évalué par imagerie du calcium et des enregistrements électrophysiologiques, est inchangé> 24 h postdissection. En outre, nous montrons que les colorants de calcium dans les cellules peuvent rester pendant des périodes prolongées sans provoquer d'effets secondaires nuisibles. L'application de ce protocole démontre que l'activité fonctionnelle des neurones dans le tissu neuronal aiguë peut être maintenue pendant de longues périodes, une fois que l'environnement extérieur est très réglementé. En outre, comme la viabilité des tissus varie grandement entre les laboratoires en raison de protocoles d'incubation différents, cette méthode établit une norme d'or pour les paramètres idéaux qui devraient être appliqués pour réduire la variabilité de la santé de neu aiguëtissus ronal.

Protocol

Le protocole suivant décrit la préparation de C57BL / 6 et C3H / He (retinally dégénéré) un tissu neuronal de la souris, mais des techniques similaires peuvent être appliquées à d'autres espèces. Tous les animaux étaient en bonne santé et manipulé avec les conditions normales de température, d'humidité, 12 h cycle lumière / obscurité, l'accès libre à la nourriture et de l'eau, et sans stimuli de stress destinés. Toutes les expériences ont été approuvées et effectuées en conformité avec comité de l&…

Representative Results

une régulation stricte de la charge bactérienne et la température du LCRa pendant l'incubation est essentiel pour maintenir la viabilité des tissus neuronaux. Ceci peut être optimisée par l' irradiation avec de la lumière UV – C et en maintenant la température du LCRa à 15 – 16 ° C (figure 1). En outre, le LCRa paramètres timbre (APS; Figure 1C) fournit l'expérimentateur avec un enregistrement des conditions environnementales (pH …

Discussion

Cet article décrit une méthode d'incubation pour prolonger la viabilité du tissu neuronal aigu pour les expériences d'imagerie et électrophysiologiques, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation des objectifs expérimentaux. Deux processus principaux régissent la détérioration du tissu neuronal au fil du temps: i) l' augmentation des niveaux de bactéries, et l'augmentation d' accompagnement dans l' endotoxine bactérienne libérée, et ii) excitotoxicité q…

Materials

Sodium Chloride	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333
N-Methyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004
D-glucose	Sigma Aldrich	G5767
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S2554
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M9272
Calcium chloride	Sigma Aldrich	223506
Papain Dissociation System	Worthington	LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance*	Life technologies	P-6867	20% solution in DMSO
Fura-2 AM	Anaspec	84017
Fluo-4 AM	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
Vibrating blade microtome	Leica Biosystem	VT1200 S	Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device
Antivibration table	Kinetic Systems Vibraplane	Vibraplane 9100/9200
Fixed Stage Upright Microscope	Olympus	BX51WI
Microscope Objective	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
Microscope Objective	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
CCD Camera	Andor	Ixon +
High speed wavelength switcher	Sutter instrument	Lambda DG-4
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
Microelectrode puller	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber	Warner Instruments	RC-40LP	Low Profile Open Bath Chambers
Software	Molecular Devices	pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler	TE Technology	CP-121
Temperature Controller	TE Technology	TC-36-25 RS232