8 시간 - 몸에서 제거되면, 신경 조직은 크게 6 후 조직의 궁극적 인 저하로 이어지는, 환경 조건에 의해 영향을 받는다. 밀접하게 모니터링하고, 조직의 세포 외 환경을 조절하는 독특한 배양 방법을 사용하여 조직 생존을 현저> 24 시간 동안 연장 될 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
해부 다음 8 시간 - 신경 조직 준비, 뇌 조각 망막 wholemount 급성, 보통 6 유지 될 수있다. 이 실험 시간을 제한 한 연구에 따라 이용되는 동물의 수를 증가시킨다. 이러한 목욕 적용 염료의 장기간의 사전 배양을 필요로 칼슘 이미징이 제한은 특별히 영향 프로토콜을. (3) 내의 박테리아 성장 지수 - 슬라이싱 후 4 시간 단단히 조직 상태의 감소와 관련된다. 본 연구는 성장 인자를 함유하는 항생제, 멸균 방법, 또는 조직 배양 배지 없이도 시간의 장기간 (> 24 h)에 대한 가능한 신경 조직을 유지하기 위하여, 급성 제제 세균의 증식을 제한하는 방법을 설명한다. UV 조사에 의해 세포 외 유체를 순환 15에서 사용자 지정 유지 챔버 내에서 조직을 유지함으로써 - 16 ° C는, 조직은 전기 생리 특성, 또는 칼슘시의 차이를 보여줍니다> 24 시간 postdissection에서 세포 내 칼슘 염료를 통해 gnaling. 이러한 방법은 급성 신경 조직을 사용하는 사람들에 대한 실험 시간을 연장 할뿐만 아니라, 실험 목적을 완료하는 데 필요한 동물의 수를 줄일 것이고, 급성 신경 조직 배양 용 금 표준을 설정한다.
서론
전기 생리학 및 기능적 영상 (칼슘, 전압 감응 염료) 신경에 가장 일반적으로 사용되는 실험 기술이있다. 뇌 슬라이스 준비하고 여기에 검사됩니다 망막 wholemount은 마취제 나 근육 이완제에서 오염없이 전기 생리 특성과 시냅스 연결을 검사하는 방법을 제공합니다. 뇌 슬라이스와 망막의 특정 회로 뇌 네트워크 (1)의 연구를 허용, 문화 또는 세포 균질 달리 구조적 무결성을 유지 wholemount. 격리 된 조직에서 녹음은 심장 박동 및 호흡과 관련된 운동으로 생체 내 녹음을 통해 이점을 제거해야합니다. 또한, 직접 시각화 대상이되는 세포의 특정 클래스 및 약리 도구 2, 3의 로컬 응용 프로그램을 할 수 있습니다.
패치 클램프 녹음 및 CALCIUM은 로딩 염료 망막 wholemount에는 망막 신경절 세포 (RGC) 층을 포함하고, 세포에 직접 액세스를 방지 멤브레인 (ILM)를 제한 이너의 존재에 의해 복잡하다. 일반적으로이 멤브레인은 하나의 셀에 기가 옴 씰의 패치 피펫 및 형성의 직접 적용 할 수 있도록 유리 피펫으로 긁어된다. 또한, 목욕 적용 칼슘 염료는 ILM....
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프로토콜
프로토콜은 아래의 C57BL / 6 및 C3H / 그는 (retinally 퇴화) 마우스의 신경 조직의 제조 방법을 설명하지만, 유사한 기술들이 다른 종에도 적용 할 수있다. 모든 동물은 건강하고 표준 온도 조건, 습도, 12 시간 조명 / 어두운주기, 음식과 물을 무료로 이용할 취급했고, 어떤 의도 스트레스 자극없이. 모든 실험 승인 및 웨스턴 시드니 대학 동물 관리 및 윤리위원회에 따라 수행하고 동물 사용 및 관리 지침 (동물 연구 기관 # A9452, # A10396 및 #의 A8967)에 따라되었다.
1. 뇌 조각 준비
- 이소 플루 란 (5 %)의 흡입에 의해 동물을 마취 및 설치류 단두대를 사용하여 목을 벨. 이전 9 설명한대로, 신속하게 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 생리 솔루션 (ACSF) (단위 : mm)를 포함 넣 : 125 염화나트륨,의 MgCl 2, 1.25의 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2를 25 2.5의 KCl, 1NaHCO3을 25 덱 스트로스 carbogen 포화 (95 % O 2 / 5 % CO 2 혼합물 310 mOsm하여 pH 7.4).
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결과
배양 중에 ACSF의 세균 부하 및 온도의 긴밀한 조절은 신경 조직의 생존을 유지하는 것이 필수적이다. 16 ° C (도 1) - 이는 UVC 광 조사 15에서 ACSF의 온도를 유지 통해 최적화 될 수있다. (도 1C APS), 다음 경우 사이의 변동성을 줄일 신경 조직을 배양 할 때 따라서 매개 변수를위한 황금 표준을 제공하고, 환경 조건의 기록 (pH와 온도.)와 실험자를 제공합니다 또한, ACSF 스탬프 매개 변수 실험.
조직 환경의 엄격한 규제를 활성화 그림 1. 배양 시스템. 냉각 펠티에 판, 주 챔버, 연동 펌프 및 UVC 챔버로 구성 배양 시스템의 A, 개략도. <.......
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토론
이 문서함으로써 실험 목표를 완료하는 데 필요한 동물의 수를 줄이고, 이미징 및 전기 생리학 실험에 급성 신경 조직의 생존을 연장하는 배양 방법을 설명합니다. 두 가지 방법은 시간에 신경 조직의 열화 관장 : ⅰ) 증가 박테리아 수준 및 방출 박테리아 독소의 동반 증가 및 외상성 슬라이싱 절차 (10)를 다음과 ⅱ) 흥분 독성. 급성 신경 조직 환경 무방비 바와 같이, 산도, 온도, 박테리아 수준 가까이 모니터링을 통해 조직 환경의 엄격한 조절은 네트워크 무결성뿐만 아니라 세포 활성을 유지하는데 필수적이다. 해부 및 조직 처리 (파파인 소화, 칼슘 염료 로딩) 실험 시간의 감소를 야기 완료를 통해 2 시간이 걸릴 수 있습니다. 그러나, 조직이 손실없이 측정> 24 시간 동안 배양 시스템에서 유지 될 수 있기 때문에 IN 생존 7, 8,이 제제는 결과> 24 시간을 얻기 .......
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공개 사항
Yossi Buskila와 Paul Breen은 급성 신경 조직용 인큐베이션 시스템 구축을 전문으로 하는 회사인 PAYO Scientific Pty Ltd의 공동 소유주임을 선언합니다. 다른 모든 저자는 현재 연구와 관련된 금전적 이해관계나 잠재적인 이해 상충을 보고하지 않습니다.
감사의 글
기술 지원을 제공해 주신 Colin Symons와 James Wright에게 감사드립니다. 이 작업은 Y.B.와 웨스턴 시드니 대학교의 혁신 사무소에 대한 시드 펀딩 보조금(WSU)의 지원을 받았습니다. MC는 ARC 펠로우십(DECRA)의 지원을 받습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 염화나트륨 | 시그마 Aldrich VETEC | V800372 | |
| 염화칼 | 시그마 Aldrich | P9333 | |
| N-메틸-D-글루카민 | 시그마 Aldrich | M2004 | |
| D-글루코스 | 시그마 알드리치 | G5767 | |
| 소듐 바이카보네이 | 시그마 알드리치 | S6014 | |
| 소듐 인산염 단일염기 | 성 시그마 알드리치 | S2554 | |
| 마그네슘 클로라이드 | 시그마 알드리치 | M9272 | |
| 염화칼슘 | 시그마 알드리치 | 223506 | |
| 파파인 해리 시스템 | Worthington | ||
| 디메틸 설폭사이드 무수 | 시그마 알드리치 | 276855 | |
| 플루로닉 F-127 저자외선 흡광* | 생명 기술 | P-6867 | DMSO 의 20% 용액; |
| 후라-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| 플루오-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| 진동 블레이드 마이크로톰 | 라이카 Biosystem | VT1200 S | 라이카 탑재 s Vibrocheck™ 측정 장치 |
| 진동 방지 테이블 | Kinetic Systems Vibraplane | 비브라플레인 9100/9200 | |
| 고정 스테이지 직립 현미경 | Olympus | BX51WI | |
| 현미경 오브렌즈 | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| 현미경 목표 | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD 카메라 | Andor | Ixon + | |
| 고속 파장 스위처 | 셔터 기기 | Lambda DG-4 | |
| 패치 클램프 증폭기 | 분자 장치 | MultiClamp 700B | |
| 데이터 수집 시스템 | 분자 장치 | Digidata 1440A | 축삭 Digidata® 시스템 |
| 붕규산 유리 모세관 | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| 미세 전극 풀러 | Sutter Instrument Co | P-97 | 화염/갈색 형 마이크로 피펫 풀러 |
| 녹음/관류 챔버 | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| 소프트웨어 | 분자 장치 | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ 라이브 셀 이미징 소프트웨어 | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| 온도 컨트롤러 | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
참고문헌
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
- Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
- Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R.
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재인쇄 및 허가
