A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging
Summary
Uma vez removido do corpo, tecido neuronal é muito afectado pelas condições ambientais, conduz a uma eventual degradação do tecido após 6-8 h. Usando um método de incubação único, que acompanha de perto e regula o ambiente extracelular do tecido, a viabilidade do tecido pode ser significativamente prolongada por> 24 h.
Abstract
Aguda preparações de tecidos neuronais, fatias de cérebro e da retina wholemount, normalmente só pode ser mantida durante 6-8 h após a dissecação. Isto limita o tempo experimental, e aumenta o número de animais que são utilizados por cada estudo. Esta limitação especificamente impactos protocolos como imagem de cálcio que exigem prolongada pré-incubação com corantes aplicados-banho. exponencial do crescimento bacteriano dentro de 3 – 4 h após o corte é fortemente correlacionada com uma diminuição na saúde dos tecidos. Este estudo descreve um método para limitar a proliferação de bactérias em preparações agudas, para manter o tecido neuronal viável durante períodos de tempo prolongados (> 24 h) sem a necessidade de antibióticos, procedimentos de esterilização, ou meios de cultura de tecidos contendo factores de crescimento. E ligando o fluido extracelular por meio de irradiação UV e manter o tecido numa câmara de retenção costume em 15-16 ° C, o tecido não mostra nenhuma diferença de propriedades electrofisiológicas, ou Si cálciognaling através corantes de cálcio intracelular em> 24 h postdissection. Estes métodos não só irá aumentar o tempo experimental para aqueles que utilizam tecido neuronal aguda, mas irá reduzir o número de animais necessários para completar objectivos experimentais, e irá definir um padrão de ouro para a incubação do tecido neuronal aguda.
Introduction
Eletrofisiologia e imagens funcionais (cálcio, tensão corantes sensíveis) são duas das técnicas experimentais mais comumente usados em neurociência. preparações fatia do cérebro e da retina wholemount, que será analisada aqui, fornecer um meio de examinar propriedades eletrofisiológicas e conectividade sináptica sem contaminação de anestésicos e relaxantes musculares. Fatias de cérebro e da retina Wholemount manter a sua integridade estrutural, ao contrário de culturas ou homogeneizados celulares, permitindo o estudo de circuitos específicos e redes cerebrais 1. Gravações de tecido isolado têm vantagens sobre em gravações vivo como os movimentos associados ao batimento cardíaco e respiração são eliminados. Além disso, a visualização direta permite que classes específicas de células a serem alvejados e aplicação local de ferramentas farmacológicas 2, 3.
gravações de patch-clamp e calcio-corante de carga em wholemount retina é complicado devido à existência da membrana interna limitante (ILM), que cobre a camada de células ganglionares da retina (RGC) e impede o acesso directo às células. Tipicamente, esta membrana é raspada com uma pipeta de vidro para permitir a aplicação directa de uma pipeta de adesivo e a formação de uma vedação gigaohm numa única célula. Além disso, os corantes de cálcio aplicado-banho não atravessar a ILM e quer deve ser injetado sob essa membrana 4, transportado retrogradamente a seguir à injecção no nervo óptico 5 ou electroporadas através do tecido 6. Além disso, quando se utiliza um modelo de roedor de retinite pigmentosa, o rato rd / rd, a ILM é mais espessa e mais impenetrável. Aqui, usamos uma técnica para remover a ILM com a digestão enzimática 7, para permitir que tanto o cálcio onipresente corante de carregamento, e acesso directo à células ganglionares da retina para patch-clamp recordiNGS 8.
gravações bem sucedidas a partir de qualquer fatias cerebrais ou da retina wholemount depender de dissecção e de incubação de tecido neuronal viável. Tipicamente, o tecido é extraído na manhã da experiência e incubada em fluido cerebrospinal artificial (aCSF) até que seja usada para gravações. Geralmente, o tecido permanece viável durante 6 – 8 h, com uma degradação significativa após esta janela de tempo. No entanto, ambas as fatias de cérebro e preparações retinae wholemount costumam produzir mais tecido do que pode ser gravado a partir de dentro deste período de tempo curto. Consequentemente, o tecido é muitas vezes descartados no final do dia e a dissecção é completada novamente nos dias subsequentes. Isso significa que um outro animal é utilizado e ~ 2 h de configuração e dissecção / coloração repetida. O protocolo seguinte descreve um método para aumentar a vida útil do tecido neuronal durante mais de 24 h, o que significa que menos animais são utilizados, e mais tempo experimental está disponível. Tissue viabilidade wcomo avaliado por meio de gravação propriedades eletrofisiológicas e dinâmica do cálcio, e essas propriedades eram indistinguíveis entre <4 h e> 24 h postdissection.
Estes resultados indicam que não só são propriedades de uma única célula intacta e funcional após incubação prolongada, mas a atividade da rede, tal como avaliado por cálcio e de imagiologia e registos electrofisiolicos, mantém-se inalterado> 24 h postdissection. Além disso, mostramos que os corantes de cálcio pode permanecer nas células durante períodos prolongados, sem causar quaisquer efeitos prejudiciais. A aplicação deste protocolo demonstra que a actividade funcional de neurónios no tecido neuronal aguda pode ser mantida por períodos longos, uma vez que o ambiente externo é altamente regulado. Além disso, como a viabilidade do tecido varia muito entre laboratórios devido a diferentes protocolos de incubação, este método estabelece um padrão de ouro para os parâmetros ideais que devem ser aplicadas para reduzir a variabilidade na saúde de neu agudatecido ronal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreve um método de incubação para estender a viabilidade do tecido neuronal aguda para geração de imagens e eletrofisiológicos experimentos, reduzindo assim o número de animais necessários para completar objetivos experimentais. Dois processos principais governam a deterioração do tecido neuronal ao longo do tempo: i) aumento dos níveis de bactérias, eo aumento de acompanhamento endotoxina bacteriana lançado, e ii) excitotoxicidade que segue o procedimento de corte traumática <sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).
Materials
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device |
| Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Camera | Andor | Ixon + | |
| High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
References
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