Förlängd inkubation av akut neuronal vävnad för elektrofysiologi och kalcium-imaging
Summary
När bort från kroppen, neuronal vävnad påverkas i hög grad av miljöförhållanden, vilket leder till eventuell försämring av vävnaden efter 6-8 timmar. Med hjälp av en unik inkubation metod, som följer noga och reglerar den extracellulära miljön i vävnaden, kan vävnad livskraft avsevärt förlängas> 24 timmar.
Abstract
Akut neuronala vävnadspreparat, hjärnan skivor och retinal wholemount, kan oftast bara upprätthållas för 6-8 timmar efter dissektion. Detta begränsar den experimentella tid, och ökar antalet djur som används per studie. Denna begränsning specifikt påverkan protokoll såsom kalcium avbildning som kräver långvarig förinkubation med bad tillämpad färgämnen. Exponentiell bakterietillväxt inom 3 – 4 timmar efter skivning är tätt korrelerade med en minskning av vävnads hälsa. Denna studie beskriver en metod för att begränsa spridningen av bakterier i akuta preparat för att bibehålla livskraftiga neuronal vävnad under längre tidsperioder (> 24 h) utan behov av antibiotika, sterila förfaranden eller vävnadskulturmedia innehållande tillväxtfaktorer. Genom att cykla den extracellulära vätskan genom UV-bestrålning och hålla vävnaden i en anpassad uppehållskammaren vid 15 – 16 ° C, visar vävnads ingen skillnad i elektrofysiologiska egenskaper, eller kalcium signaling genom intracellulära kalcium färgämnen på> 24 timmar postdissection. Dessa metoder kommer inte bara förlänga experimentell tid för dem som använder akut neuronal vävnad, men kommer att minska antalet djur som krävs för att slutföra experimentella mål, och kommer att sätta en gold standard för akut neuronal vävnad inkubation.
Introduction
Elektro och funktionell avbildning (kalcium, spänningskänsliga färgämnen) är två av de vanligaste experimentella tekniker inom neurovetenskap. Brain skiva förberedelser och retinal wholemount, som kommer att undersökas här, tillhandahålla ett sätt att undersöka elektrofysiologiska egenskaper och synaptiska uppkoppling utan kontaminering från anestetika eller muskelavslappnande medel. Hjärnan skivor och retinal wholemount bibehåller sin strukturella integritet, till skillnad från kulturer eller cellhomogenat, vilket gör att utredningen av specifika kretsar och hjärnnätverk 1. Inspelningar från isolerad vävnad har fördelar jämfört med in vivo-inspelningar som rörelser i samband med hjärtslag och andning elimineras. Dessutom möjliggör direkt visualisering specifika klasser av celler som skall riktade och lokal tillämpning av farmakologiska verktyg 2, 3.
Patch-clamp inspelningar och calcium färg belastning i retinal wholemount kompliceras av förekomsten av inre avgränsande membranet (ILM), som omfattar näthinneganglieceller (RGC) skikt och förhindrar direkt tillgång till cellerna. Normalt är detta membran skrapas bort med en glaspipett för att tillåta direkt applicering av ett plåster pipett och bildandet av en gigaohm tätning på en enda cell. Dessutom har bad appliceras kalcium färgämnen inte korsa ILM och måste antingen injiceras under detta membran 4, retrograd transporteras efter injektion i synnerven 5 eller elektro genom vävnaden 6. Dessutom när man använder en gnagare modell av retinitis pigmentosa, är rd / rd musen ILM tjockare och mer ogenomträngligt. Här använder vi en teknik för att avlägsna ILM med enzymatisk spjälkning 7, för att tillåta både allestädes närvarande kalcium färgämne lastning, och direkt tillgång till näthinneganglieceller för patch-clamp recordings 8.
Framgångsrika inspelningar från antingen hjärnan skivor eller retinal wholemount beror på dissekering och inkubation av livskraftig nervvävnad. Typiskt vävnad utvinns på morgonen av experimentet och odlades i artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) tills det används för inspelningar. Vanligtvis vävnad förblir lönsamt för 6 – 8 timmar, med betydande nedbrytning efter denna tid. Men både hjärnan skivor och wholemount retinae preparat producerar oftast mer vävnad än vad som kan registreras inifrån denna korta tid. Följaktligen vävnad ofta kasseras vid slutet av dagen och dissektion är klar igen på efterföljande dagar. Detta innebär ett annat djur utnyttjas och ~ 2 timmar av installation och dissektion / färgning upprepas. Följande protokoll beskriver en metod för att förlänga livslängden för neuronal vävnad under mer än 24 h, vilket innebär färre djur utnyttjas, och mer experimentell tid är tillgänglig. Vävnadsviabilitet wenligt bedömning genom inspelning elektrofysiologiska egenskaper och kalcium dynamik, och dessa egenskaper var oskiljbara mellan <4 timmar och> 24 h postdissection.
Dessa resultat tyder på att det inte bara är encelliga egenskaper intakta och funktionella efter förlängd inkubation, men nätverksaktivitet, mätt med kalcium-avbildning och elektrofysiologiska inspelningar, är oförändrad> 24 h postdissection. Dessutom visar vi att kalcium färgämnen kan förbli i cellerna under längre tidsperioder utan att orsaka några skadliga effekter. Tillämpningen av detta protokoll visar att den funktionella aktiviteten av nervceller i akut neuronal vävnad kan upprätthållas under långa perioder, när den yttre miljön är hårt reglerad. Eftersom vävnadsviabilitet varierar kraftigt mellan laboratorier på grund av olika inkubation protokoll, denna metod fastställer en guldstandard för den perfekta parametrar som ska användas för att minska variationen i hälsa akut neuronal vävnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den här artikeln beskriver en inkubationstid metod för att förlänga livskraften hos akut neuronal vävnad för avbildning och elektrofysiologiska experiment, vilket minskar antalet djur som behövs för att slutföra experimentella mål. Två huvudprocesser styr försämring av neuronal vävnad med tiden: i) ökade bakterienivåer, och den åtföljande ökningen av bakteriell endotoxin släpptes och ii) excitotoxicitet som följer den traumatiska skiv förfarande 10. Som akut neuronal vävnad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).
Materials
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device |
| Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Camera | Andor | Ixon + | |
| High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
References
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).
- Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
- Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
- Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396 (2014).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588 (2015).
- Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
- Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
- Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
- Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , (2015).
- Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
- Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
- Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
