Sundhedstilstanden af lungen reflekteres af typen og antallet af immunceller, der er til stede i bronkioler i lungerne. Vi beskriver en bronkoalveolær lavage teknik, der muliggør isolering og undersøgelse af vedhæftede celler og opløselige faktorer fra de nedre luftveje hos mus.
Bronchoalveolære Lavage (BAL) er en eksperimentel procedure, der bruges til at undersøge cellulære og acellulære indhold af lungen lumen ex vivo for at få indsigt i en igangværende sygdomstilstand.
Her er en enkel og effektiv metode, der er beskrevet til at udføre BAL på murine lunger uden brug af specialværktøj eller udstyr. BAL-væske isoleres ved at indsætte et kateter i luftrøret af terminalt bedøvede mus, hvorigennem en saltopløsning inddryppes i bronkioler. Den indpodet fluid forsigtigt trukket tilbage for at maksimere BAL fluid hentning og for at minimere forskydningskræfter. Denne teknik tillader levedygtigheden, funktion og struktur af celler i luftvejene og BAL-væsken skal bevares.
Talrige teknikker kan anvendes for at opnå yderligere forståelse af sygdomstilstanden af lungen. Her, en almindeligt anvendt teknik til identifikation og optælling af forskellige typer af immunceller erBeskrevet, hvor flowcytometri kombineres med et udvalg af fluorescensmærkede celleoverfladespecifikke markører. BAL-proceduren, der præsenteres her, kan også bruges til at analysere infektiøse agenser, væskestoffer eller inhalerede partikler i murine lunger.
Luftvejene støder på mange fornærmelser, som kan føre til betændelse, patogeninvasion eller ondartet transformation. Epithelcellerne, der linjer lunnlumenet, danner en af de store barrierer i pattedyrskroppen. Sammen med alveolære makrofager forhindrer de miljømæssige trusler i at komme ind i det systemiske system via luftvejene. Eksempler på sådanne trusler indbefatter organiske og uorganiske kemikalier, bakterier og vira. På samme måde kan specifikke immuniseringer eller terapeutiske indgreb være designet til at målrette mod lungerne. I alle disse tilfælde er en uddybet analyse af det fremkaldte respons vigtigt at forstå, gribe ind eller forhindre biologiske processer, der finder sted i respirationssystemet.
Bronchoalveolar lavage (BAL) er en uvurderlig metode til at analysere sådanne svar, da de resulterende prøver indeholder vigtige oplysninger om de inflammatoriske responser, immunmekanismer og infektionssygdomsprogressionder kan forekomme i de pulmonale luftveje 1, 2. Ved at bruge BAL, er det muligt at studere de infiltrerende celler. Dette står i kontrast med fordøjede lunger, der giver et "beskidt" cellepopulation, med mange døde og klæbrige celler. BAL udføres ved at indføre en saltvandsopløsning i de terminale bronkioler og efterfølgende udvinding denne opløsning. Den hentede opløsning kan derefter anvendes til at kvantificere og fænotypisk analyse hjemmehørende lunge og infiltrerende inflammatoriske celler. Denne metode er ofte anvendt til at studere cellulære indstrømning i sygdomsmodeller i luftvejene, såsom astma, kronisk obstruktiv lungesygdom (COPD), og infektiøse sygdomsmodeller. Bortset fra den cellulære sammensætning, er den molekylære sammensætning af de pulmonære luftveje afspejles også i BAL-væsken. At analysere dette, kan Enzymforbundet immunosorbentassay (ELISA), immunoblot, og den samtidige analyse af flere cytokiner ved et cytokin bead matrix væreUdført for at vurdere tilstedeværelsen af cytokiner og kemokiner.
BAL er en veletableret metode til at studere tilstrømningen af inflammatoriske celler i inflammatoriske respiratoriske sygdoms dyremodeller. Observationen af en ændret cellulær tilstrømning ( f.eks. Forøgede niveauer af lymfocytter, eosinofiler eller neutrofiler) kan føre til bedre indsigt i sygdommen og kan være en objektiv parameter til vurdering af præstationen af en terapeutisk intervention.
Den nøjagtige og reproducerbare fortolkning af BAL-cellanalyse kræver, at BAL udføres korrekt, og at den opsamlede væske håndteres og behandles ordentligt. Udtrykket "bronchial lavage" blev introduceret mere end 80 år siden af Stitt 3 . I 1961 opnåede Myrvik alveolære makrofager fra lavvæske fra kaninungene 3 . BAL er nu en almindeligt anvendt metode til at analysere og overvåge lungerne i musemodellen, dogRe er stadig ingen rapport om en standardiseret BAL-procedure i den videnskabelige litteratur 4 , 5 . Desuden er der sandsynligvis så mange måder at udføre BAL, da der findes forskningslaboratorier ved hjælp af teknikken 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Det er vigtigt, at de data, der er opnået fra BAL, repræsenterer hele den murine lunge, og ikke kun en del af lungen. Denne form for variabilitet komplicerer fortolkningen og sammenligningen af resultaterne mellem forskellige forsøg.
Her beskrives en grundlæggende, billig og reproducerbar BAL-procedure, som tillader opsamling af den cellulære og opløselige fraktion, som er til stede i musens luftvejslumen. Kort sagt placeres et kateter i den eksponerede luftrør ofa terminalt bedøvede mus. En sprøjte er forbundet med kateteret, og en pufret saltvandsopløsning indeholdende ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) indføres i lungerne. Lunge lumen samples ved forsigtig gentagen skylning af saltopløsningen ved hjælp af stemplet. Det negative tryk påført i dette trin er minimal at forhindre luftvejskollaps. Efter opsamling, bør den opnåede BAL behandles yderligere til at optælle og identificere cellerne ved flowcytometri.
BAL er en nyttig teknik til at opnå cytologisk og biokemisk information som reaktion på infektioner eller lægemidler. I første omgang blev BAL brugt til at styre den overdrevne slimproduktion hos mennesker, der lider af fosgen toksicitet 3 . I dag bruges teknikken til mennesker til at undersøge lungepathogenese, diagnose og terapeutisk behandling af sygdomme 3 , 24 . I forsøgsdyr bruges BAL almindeligt til at overvåge inflammatoriske reaktioner, immunmekanismer og infektionssygdomme, der forekommer i lungeluftvejene 1 , 2 .
For at studere det inflammatoriske cellulære mønster i respiratoriske sygdomsmodeller bør BAL efterfølges af absolut og differentiel celletælling. Udover det absolutte celleantal er de relative celle tal også af interesse. For eksempel viser reparations- og kræftmodeller vEry lille eller ingen BAL celletælling stiger. I denne model er vurderingen af cellulær sammensætning nyttig. Ved anvendelse af cellefarvning kombineret med lysmikroskopi kan forskellige celletyper, såsom eosinofiler, neutrofiler, makrofager og lymfocytter identificeres baseret på morfologi 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Flowcytometri kan anvendes til specifikke vurderinger, såsom at identificere forskellige T-cellefænotyper 7 , 31 . Udover identifikationen af de forskellige infiltrerende cellepopulationer kan lungens ikke-cellulære sammensætning undersøges ved anvendelse af BAL. Metoder såsom ELISA, immunblot, cytokinperle-array, immunhistokemi og kvantitativ polymerasekædereaktion udføres på BAL-væske for at bestemme cytokiner, vækstFaktorer og andre inflammatoriske komponenter. For at bestemme lungeskader kan total protein og lactat dehydrogenase niveauer i BAL væsken også måles 32 , 33 .
Med udviklingen af nye diagnostiske værktøjer vil den genomiske og proteomiske karakterisering af BAL-komponenter være mulig i nær fremtid. Kombinationen af ekspanderende beregningsmuligheder og high-throughput genekspressionsteknologier vil gøre det muligt at definere specifikke genekspressionsprofiler for forskellige sygdomstilstande. Udførelse af disse teknikker på BAL-væske kan tilvejebringe gen- og proteinekspressionsmønstre for at identificere de vigtige molekyler involveret i de forskellige faser af lungesygdomme.
Hovedbegrænsningen af data opnået fra BAL-væske er manglen på sammenlignelighed mellem forskellige forsøgsforsøg 3 , 9 . Der er en høj grad afVariabilitet i lavage teknik og den efterfølgende behandling af BAL væske. For at kunne sammenligne hvert BAL-forsøg er det nødvendigt at standardisere typen af skyllevæske, der er indstillet, instillationsstedet og den fraktion, der skal analyseres for cellulær og ikke-cellulær sammensætning. Der er signifikante forskelle i antallet af lavagefraktioner mellem forskellige forsøg, varierende fra en til 14 gange 34 , 35 , 36 . Denne forskel kan have indflydelse på de estimerede samlede celleantal i lungerne. Det er vigtigt at vide, hvilken BAL væske fraktion indeholder størstedelen af cellerne. Song et al. Viste, at ca. 70% af det samlede antal celler blev hentet i fraktion en til tre 22 . Andre rapporter foreslog dog, at den anden lavage indeholdt flere celler end den første 37 , 38 </sup>. Vi kan konkludere fra disse undersøgelser, at en skylning med kun en fraktion ikke repræsenterer hele lungen, hvilket fører til fejlfortolkning af resultaterne.
Den ikke-cellulære sammensætning af BAL-væsken indeholder værdifulde oplysninger om sundhedstilstanden af lungen 33 , 39 , 40 . Variationer i fortyndingen af BAL-væsken bidrager til forskellen i kvantificeringen af den opløselige fraktion og følgelig til forskelle i resultaterne mellem forsøgene. Song et al. Sammenlignede protein- og lactatdehydrogenase-niveauerne for hver lavagefraktion og konkluderede, at den første lavagefraktion indeholdt to til tre gange mere end den anden fraktion.
For at hente en repræsentativ BAL-prøve til analyse er nogle tekniske overvejelser afgørende. En af dem er at udføre ordentlig bedøvelse. Det er meget vigtigt at kontrollere fodrefleksenlex af musen for at sikre terminal sedation. Det er ikke kun vigtigt for etiske grunde, men også fordi det er svært at placere og fastholde kateteret i den korrekte position, hvis musen ikke er korrekt bedøvet.
En anden vigtig teknisk overvejelse er placeringen af i luftrøret kateteret. Når der indsættes for dybt kateteret, kan det beskadige lungestrukturen. Den distale ende af kateteret skal ikke nå lungerne under BAL proceduren. Kateteret bør også stabiliseres og bundet med en bomuldstråd. Hvis kateteret ikke er stabiliseret, kan den injicerede saltopløsning strømme opad ind i næsehulen i stedet for ned i lungerne. Under injektion og aspiration af saltopløsningen, er det vigtigt at holde kateteret konstant.
Opnået fra BAL-væsken data skal repræsentere hele murine lunge. Derfor er det vigtigt at indpode et tilstrækkeligt volumen saltvand puffer (dvs.3 ml, opdelt i 3 portioner på 1 ml hver). Der er noget lineært forhold mellem celleudbytte og BAL-væsken udbytte. Det er vigtigt at samle løsningen blidt mens masserer brystkassen af musen. Hvis forskydningskræfter er for stærk, kan levedygtigheden, funktion og struktur af celler i luftvejene og BAL-væsken være kompromitteret. Hvis den aspirerede væske ikke er synlig i sprøjten, bevæger omhyggeligt kateteret dybere eller højere i luftrøret.
Særlig meddelelse skal gives til specifikke aspekter af BAL behandling og analyse. Dette vil maksimere oplysninger bevaret fra BAL-prøver. Efter BAL er cellerne i et næringsfattigt saltvandsmedium. Det er derfor meget vigtigt at behandle prøverne inden for 1 time efter BAL prøveudtagning. Hvis langvarig lagring er nødvendig, kræves anvendelsen af et næringsstof-suppleret medium.
At bevare cellelevedygtighed, undgå rør, som fremmer cellevedhæftning til overfladen. Undgå centrifugation af cellesuspensioner ved hastigheder, der sandsynligvis vil kompromittere cellulær integritet eller for at undgå ensartet resuspension af de hentede BAL-celler. BAL væske indeholdende celler skal centrifugeres ved 400 xg og 4 ° C i 7 min. Det er vigtigt at huske på, at der bør holdes cellesuspensioner ved 4 ° C under behandlingen.
The authors have nothing to disclose.
LVH er forskningsassistent ved Institut for Biomedicinsk Molekylær Biologi på Ghent Universitet. ERJ er støttet af UniVacFlu, er tilskud nummer 607690. KR støttet af EF-FP7 projekt FLUNIVAC.
balanced salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
ethyleendiaminetetra acetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
23G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0,60 x 30 mm |
26G x 1/2 neelde | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0,45*12 mm |
plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D 0.58 mm (.023") O.D. .965 mm (0.38") 30.5m (100') |
sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
1ml syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | non pyrogenic and non toxic |
Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
centrifuge tube 50 ml | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
centrifuge tube 15 ml | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
microcentrifuge tube 1,5 ml | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile filtered |
live/dead -efluor506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
flow cytometer | BD Biosciences | ||
catheter | BD Biosciences | 393202 |