Forbedret Sample Multiplexing av vev ved hjelp Kombinert Precursor Isotop Merking og isobariske Tagging (cPILOT)
Summary
Kombinert forløper isotopisk merking og isobarisk merking (cPILOT) er en kvantitativ proteomforskning strategi som øker samplings multipleksing av egenskapene til isobariske koder. Denne protokollen beskriver anvendelsen av cPILOT til vev fra en Alzheimers sykdom musemodellen og villtype-kontroller.
Abstract
Det er et økende behov for å analysere mange biologiske prøver for sykdomsforståelse og biomarkører. Kvantitative proteomikk strategier som tillater samtidig måling av flere prøver har blitt utbredt og sterkt redusere eksperimentelle kostnader og tid. Vårt laboratorium utviklet en teknikk som kalles kombinert forløper isotopisk merking og isobarisk merking (cPILOT) som forsterker prøve multipleksing av tradisjonell isotopisk merking eller isobariske merkings tilnærminger. Global cPILOT kan anvendes på prøver som stammer fra celler, vev, kroppsvæsker, eller hele organismer og gir informasjon om relative protein abundances på tvers av forskjellige prøvebetingelser. cPILOT fungerer ved 1) ved bruk av lave pH-buffer-betingelser for selektivt å dimethylate peptid N-termini og 2) ved hjelp av høy pH-buffer-betingelser for å merke av primære aminer med lysinresidiene med kommersielt tilgjengelige isobariske reagenser (se tabell of Materials / reagenser). Graden avPrøven multipleksing tilgjengelig er avhengig av antallet av forløper etiketter som brukes og den isobariske merking reagens. Her presenterer vi en 12-plex analyse ved hjelp av lette og tunge dimetylering kombinert med seks-plex isobariske reagenser for å analysere 12 prøver fra musevev i en enkelt analyse. Forbedret multipleksing er nyttig for å redusere eksperimentelle tid og kostnader, og enda viktigere, å tillate sammenligning av mange prøvebetingelser (biologiske replikater, sykdomstrinn, medikamentbehandlinger, genotyper, eller langsgående gangene) med mindre eksperimentelle skjevhet og feiling. I dette arbeidet, er den globale cPILOT fremgangsmåten som brukes til å analysere hjerne, hjerte, og levervev gjennom biologiske replikater fra en Alzheimers sykdom musemodellen og villtype-kontroller. Global cPILOT kan brukes til å studere andre biologiske prosesser og er innrettet til å øke prøve multipleksing til mer enn 20 prøver.
Introduction
Proteomics innebærer ofte analyse av mange prøver som brukes for å bedre forstå sykdomsprosesser, enzymkinetikk, post-translasjonelle modifikasjoner, respons på miljømessige stimuli, respons til terapeutiske behandlinger, biomarkører, eller medikament mekanismer. Kvantitative metoder kan bli anvendt for å måle relative forskjeller i proteinnivåer på tvers av prøvene og kan være markør-fri eller involvere isotopisk merking (metabolske, kjemisk eller enzymatisk). Stabile isotoper merkingsmetoder har vokst i popularitet fordi de tillater mange prøver som skal analyseres samtidig og er egnet for prøver fra forskjellige celler, vev, kroppsvæsker, eller hele organismer. Isotop merking metoder 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 økning eksperimentelle gjennomstrømning,samtidig redusere innhentingstiden, kostnader, og eksperimentelle feil. Disse metodene brukes forløper masse-spektra for å måle relative forekomster av proteiner fra peptid-topper. I motsetning til dette, isobariske tagging reagenser 8, 9, 10 generere reporter ioner som enten er påvist i MS / MS eller MS 3 11 spektra og disse toppene blir brukt til å rapportere om relative Forekomsten av proteiner.
Den nåværende state-of-the-art i proteomforskning multipleksing er enten en 10-plex 12 eller 12-plex isobarisk tag analyse 13. Forbedret prøve multipleksing (dvs.> 10 prøver) metoder har blitt utviklet av vårt laboratorium for vev 14, 15, 16, 17, og av andre for analyse av celler 18 </sup>, 19, 20, 21 vev eller målrettede peptider 22. Vi har utviklet en forbedret multipleksing teknikk som kalles kombinert forløper isotopisk merking med tagging isobarisk (cPILOT). Global cPILOT er nyttig for å få informasjon om de relative konsentrasjoner av alle proteiner på tvers av forskjellige prøvebetingelser (≥12) 14. Figur 1 viser en generell cPILOT arbeidsflyt. Tryptiske eller Lys-C-peptider blir selektivt merkes ved N-enden med dimetylering ved hjelp av lav pH 2 og ved lysinrester med 6-plex-reagenser med høy pH-verdi. Denne strategien dobler antallet prøver som kan analyseres med isobariske reagenser som bidrar til å redusere eksperimentelle kostnader og i tillegg reduserer eksperimentelle trinn og tid.
cPILOT er fleksibel som vi har utviklet andre metoder for å studere oksidativ post-translasjonell modifications, inkludert 3-nitrotyrosine-modifiserte proteiner 14 og cystein-inneholdende peptider med S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23. Vi har også utviklet en aminosyre selektiv tilnærming, cystein cPILOT (cyscPILOT) 17. MS 3 anskaffelse med en topp-ion 11 eller selektiv-y 1 -ion metode 15 kan bidra til å redusere reporter ion interferensen og bedre kvantitativ nøyaktighet cPILOT. Bruken av MS 3 i anskaffelse metoden krever en høy oppløsning instrument med en orbitrap masseanalysatoren selv med lav oppløsning ion trap instrumenter kan også fungere 24.
Tidligere cPILOT har blitt brukt til å studere leverproteiner 16 fra en Alzheimers sykdom musemodell. Her beskriver vi hvordan du utfører global cPILOT analyse ved hjelp av hjernen, hjertet og leverhomogenater å studere rollen av perifere produkterry i Alzheimers sykdom. Dette forsøk omfatter biologisk replikasjon. På grunn av allsidigheten cPILOT, kan interesserte brukere bruke teknikken til å studere andre vev for en rekke biologiske problemer og systemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
cPILOT tillater samtidig måling av mer enn 12 unike prøver. For å sikre en vellykket merking på både N-terminale og lysinrester av peptider, er det viktig å ha den riktige pH-verdi for hvert sett av reaksjoner og for å utføre den dimetylering reaksjonen først for peptid merking. Selektiv dimetylering ved den N-terminale enden blir utført ved å ha en pH-verdi på ~ 2,5 (± 0,2). Dette oppnås ved å utnytte forskjellene på pKa-verdier for de aminogruppene på lysin og N-terminalen. Ved pH 2,5, er lysin inakti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne erkjenner University of Pittsburgh oppstart Funds og NIH, NIGMS R01 stipend (GM 117191-01) til RASR.
Materials
| Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13 C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) – 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC – Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | – | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | – | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient. |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a ph meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of ph buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand ph buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
References
- Ong, S. -. E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Koehler, C. J., Arntzen, M. &. #. 2. 1. 6. ;., de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
- Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, . From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , (1998).
- Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
- Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
- Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
- Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS – Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
- Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
- Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
- Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
- Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer’s disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
