לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)
Summary
תיוג מבשר איזוטופים בשילוב ותיוג isobaric (cPILOT) הוא אסטרטגית פרוטאומיקה כמותית המשפר יכול ריבוב מדגם של תגי isobaric. פרוטוקול זה מתאר את היישום של cPILOT לרקמות מתוך שולטת מודל עכבר מחלת אלצהיימר ו wild-type.
Abstract
ישנה דרישה גוברת לנתח דגימות ביולוגיות רבות להבנת מחלות גילוי סמן ביולוגי. אסטרטגיות פרוטאומיקה כמותיות המאפשרות מדידה בו זמנית של מספר דגימות הפכה נפוצה לצמצם במידה ניכרת את עלויות וזמניות ניסיוני. המעבדה שלנו פיתחה טכניקה הנקראת מבשר בשילוב תיוג איזוטופי ותיוג isobaric (cPILOT), אשר משפר מדגם ריבוב של תיוג איזוטופי מסורתיים או גישות תיוג isobaric. cPILOT העולמי ניתן ליישם דגימות שמקורם בתאים, ברקמות, נוזלי גוף, או אורגניזמים שלמים נותן מידע על שכיחותם יחסית חלבון על פני תנאים מדגמים שונים. cPILOT עובד ע"י 1) באמצעות תנאי חיץ pH נמוכים כדי פפטיד dimethylate סלקטיבי N-טרמיני 2) באמצעות תנאי חיץ pH הגבוה לתייג אמינים ראשוניים של שאריות ליזין עם ריאגנטים isobaric-זמינים מסחרי (ראה טבלה של חומרים / ריאגנטים). המידהריבוב המדגם זמין תלוי מספר ההתוויות מבשרות משומשות מגיב תיוג isobaric. כאן, אנו מציגים ניתוח 12-Plex באמצעות קל וכבד dimethylation בשילוב עם שש-Plex ריאגנטים isobaric לנתח 12 דגימות מרקמות עכבר בניתוח יחיד. ריבוב משופר מועיל להקטנת זמן ניסיוני ועלות וחשובה יותר, מה שמאפשר השוואה על פני תנאים מדגמים רבים (ביולוגי משכפלות, שלב מחלה, טיפולים תרופתיים, גנוטיפים, או בזמן נקודות אורכות) עם הטיה וטעייה ניסיוניות פחות. בעבודה זו, גישת cPILOT הגלובלית משמשת כדי לנתח מוח, לב, כבד ורקמות ברחבי ביולוגי משכפל ממודל עכבר מחלת אלצהיימר בקרות מסוג פרא. ניתן ליישם גלובל cPILOT ללמוד תהליכים ביולוגיים אחרים ומותאם להגדיל ריבוב מדגם גדול מ 20 דגימות.
Introduction
פרוטאומיקה קרובות כרוך הניתוח של דגימות רבות השתמשו כדי להבין טוב יותר תהליכי מחלה, קינטיקה אנזימטית, ופוסט translational שינויים, בתגובה לגירויים סביבתיים, בתגובת טיפולים רפואיים, גילוי סמן ביולוגי, או מנגנוני סמים. יכול להיות מועסק שיטות כמותיות למדוד הבדלים ביחס ברמות החלבון ברחבי דגימות וניתן ללא תווית או לערב תיוג איזוטופי (מטבולית, כימיים, או אנזימטי). שיטות תיוג איזוטופ יציבות גדלו ב פופולרי כי הם מאפשרים דגימות רבות להיות מנותחות בו זמנית ומתאימים דגימות מתאים שונים, רקמות, נוזלי גוף, או אורגניזמים שלמים. תיוג איזוטופ שיטות 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 תפוקה ניסיון עלייה,תוך צמצום זמן רכישה, עלויות, וטעייה ניסיונית. שיטות אלה להשתמש ספקטרה המונית מבשר למדוד שכיחותם היחסית של חלבונים מן הפסגות פפטיד. לעומת זאת, ריאגנטים תיוג isobaric 8, 9, 10 יוצרים יונים כתב כי מזוהים או ב MS / MS או MS 3 11 ספקטרום ופסגות אלה משמשים לדווח על שכיחותם היחסית של חלבונים.
הזרם המדינה- of-the-art ריבוב פרוטאומיקה הוא או ניתוח תג isobaric 10-Plex 12 או 12-Plex 13. ריבוב מדגם משופר (כלומר> 10 דגימות) שיטות פותחו על ידי המעבדה שלנו עבור רקמות 14, 15, 16, 17, ועל ידי אחרים לניתוח תאים 18 </sup>, 19, 20, רקמות 21, או פפטידים ממוקדים 22. פתחנו טכניקת ריבוב משופרת שנקראת תיוג איזוטופי מבשרים בשילוב עם תיוג isobaric (cPILOT). CPILOT גלובל שימושי להשגת מידע על הריכוזים היחסיים של כל החלבונים על פני תנאים מדגמים שונים (≥12) 14. איור 1 מציג את זרימת העבודה cPILOT בכלל. פפטידים tryptic או ליס-C מסומנים באופן סלקטיבי על הסופית- N עם dimethylation באמצעות נמוך pH 2 ובבית שאריות ליזין עם ריאגנטים 6-Plex באמצעות pH גבוה. אסטרטגיה זו מכפילה את מספר הדגימות כי ניתן לנתח עם ריאגנטים isobaric שעוזרים להפחית עלויות ניסוי ובנוסף, מפחית צעדים וזמן הניסיונות.
cPILOT היא גמישה כמו פיתחנו שיטות אחרות כדי ללמוד חמצוני ופוסט translational מודיfications, כולל חלבונים 3-modified-nitrotyrosine 14 ופפטידים המכילים ציסטאין עם S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23. גם פיתחנו חומצת אמינו גישה סלקטיבית, cPILOT ציסטאין (cyscPILOT) 17. רכישת MS 3 עם שיטת 11-יון עליון או סלקטיבית-y 1 -ion 15 יכול לעזור להפחית פרעות כתב יון ולשפר את דיוק כמותית של cPILOT. שימוש MS 3 בשיטת הרכישה דורש מכשיר ברזולוציה גבוהה עם נתח מונית orbitrap למרות מכשירי מלכודת יונים ברזולוציה נמוכה עשויים גם לעבוד 24.
בעבר, cPILOT נוצל בעבר ללמוד חלבונים בכבד 16 ממודל העכבר מחלת האלצהיימר. כאן, אנו מתארים כיצד לבצע ניתוח cPILOT הגלובלית באמצעות המוח, הלב, ואת homogenates הכבד כדי ללמוד את התפקיד של peripheר"י במחלת האלצהיימר. ניסוי זה משלב שכפול ביולוגית. בגלל הרבגוניות של cPILOT, משתמשים מעוניינים יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי ללמוד ברקמות אחרות עבור מגוון של בעיות ומערכות ביולוגיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
cPILOT מאפשרת מדידה בו זמנית של יותר מ 12 דגימות ייחודי. על מנת להבטיח תיוג מוצלח בשני שאריות N- הסופית וליזין של פפטידים, זה הכרחי כדי לקבל את ה- pH הנכון עבור כל קבוצה של תגובות ולבצע את התגובה dimethylation הראשון עבור תיוג פפטיד. dimethylation סלקטיבי על הסופית- N מבוצע על ידי בעל pH ב ~ 2….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים מאוניברסיטת פיטסבורג קרנות הזנק NIH, מענק R01 NIGMS (GM 117,191-01) כדי RASR.
Materials
| Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13 C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) – 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC – Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | – | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | – | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient. |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a ph meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of ph buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand ph buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
References
- Ong, S. -. E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Koehler, C. J., Arntzen, M. &. #. 2. 1. 6. ;., de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
- Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, . From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , (1998).
- Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
- Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
- Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
- Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS – Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
- Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
- Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
- Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
- Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer’s disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
