Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)
Summary
Kombine ön-madde izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) izobarik etiketlerin örnek çoğullama kabiliyetini arttıran bir sayısal proteomik stratejisidir. Bu protokol bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden dokulara cPILOT uygulanmasını tarif etmektedir.
Abstract
Hastalık anlayış ve biyomarker keşfi için birçok biyolojik numunelerin analiz etmek giderek artan bir talep vardır. Birden numunelerin eş zamanlı ölçümü yaygın hale gelir ve büyük ölçüde deneysel maliyetleri ve sürelerini azaltmak gelmiş izin kantitatif proteomik stratejileri. Laboratuvarımız geleneksel izotopik etiketleme veya İzobarik etiketleme yaklaşımların örneği çoklama artırır izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) kombine habercisi olarak adlandırılan bir teknik geliştirdi. Küresel cPILOT hücreler, dokular, vücut sıvıları veya bütün organizmalardan gelen örnekleri uygulanmış ve farklı örnek koşullar arasında görece protein bolluk hakkında bilgi verir edilebilir. cPILOT düşük pH'li bir tampon koşulları kullanılarak: 1) ile çalışır seçici dimethylate peptit, N-terminali ve 2)) Malzemeler / Reaktifler bakınız Tablo (ticari olarak temin edilebilen izobarik reaktifler ile lizin kalıntılarının birincil aminler etiket için yüksek pH tampon koşulları kullanılmasına ilişkindir. derecesiMevcut örnek çoğullama kullanılan ön-madde etiket sayısı ve izobarik etiketleme reaktifi bağlıdır. Burada, tek bir analizde fare dokularından 12 örnekleri analiz etmek için, altı-karmaşık izobarik reaktifler ile birleştirilmiş hafif ve ağır dimetilasyon kullanarak 12-karmaşık analizini. Geliştirilmiş çoğullama az deneysel önyargı yanılma ile, daha da önemlisi, deneysel zaman ve maliyet ve azaltarak birçok örnek koşullarına (biyolojik çoğaltır, hastalık evresi, ilaç tedavileri, genotipi veya boyuna zaman noktalarında) arasında karşılaştırma izin verdiği için yararlıdır. Bu çalışmada, küresel cPILOT yaklaşım Alzheimer hastalığı fare modeli ve sokak türü kontrollerden beyin, kalp, ve biyolojik çoğaltır genelinde karaciğer dokuları analiz etmek için kullanılır. Küresel cPILOT diğer biyolojik süreçleri incelemek için uygulanan ve 20'den daha fazla numune numune çoğullama artırmak için adapte edilebilir.
Introduction
Proteomiks genellikle daha iyi hastalık süreçlerini anlamak için kullanılan pek çok numune, enzim kinetiği, post-translasyonel modifikasyonlar, çevresel uyarılara yanıt ve terapötik tedaviler, belirleyici keşif ya da ilaç mekanizmalarına müdahale analizini içerir. Nicel yöntemler örnekleri üzerinden protein seviyelerinde göreli farklarını ölçmek için ve etiketsiz olabilir ya da izotopik etiketleme (metabolik, kimyasal ya da enzimatik) içeren kullanılabilecektir. pek çok örnekler eş zamanlı olarak analiz edilmesine izin verir ve farklı hücreler, dokular, vücut sıvıları veya bütün organizmalardaki örnekler için uygundur, çünkü kararlı izotop etiketleme yöntemleri popülaritesi büyüdü. İzotop etiketleme yöntemleri, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 artış deneysel verim,edinme zamanı, maliyetleri ve deneysel hatayı azaltırken. Bu yöntemler, peptid tepelerinden proteinlerin nispi bolluklarını ölçmek için ön-madde kütle spektrumları kullanın. Bunun aksine, izobarik etiketleme ayıraçları 8, 9, 10 ya da MS / MS veya MS tespit edilir raportör iyonları üreten 3 11 spektrumları ve bu tepe proteinlerin nispi bolluk rapor etmek için kullanılır.
Proteomik çoklama mevcut state-of-the-art 12 10-karmaşık veya 12-karmaşık izobarik etiket analizi 13 ya da bir. Geliştirilmiş örnek çoklayıcı (yani> 10 numune) yöntemleri hücrelerde 18 analizi için başkaları tarafından dokular 14, 15, 16, 17 için laboratuarda geliştirilmiş ve edilmiştir </sup>, 19, 20, 21, ya da hedef peptidleri 22 dokular. Biz İsobarik etiketleme (cPILOT) ile kombine öncü izotopik etiketleme denilen gelişmiş bir çoğullama teknik geliştirdi. Küresel cPILOT farklı örnek koşullarında (≥12) 14 üzerindeki tüm proteinlerin nispi konsantrasyonları hakkında bilgi almak için kullanılır. Şekil 1, genel bir cPILOT akışını gösterir. Triptik veya Lys-C peptidler seçici düşük pH 2 ile dimetilasyon N-terminalinde ve yüksek pH değeri 6-karmaşık reaktifler ile lizin kalıntılarında etiketlenir. Bu strateji, deney maliyetleri ve ek azaltmaya yardımcı olur izobarik reaktifler ile analiz edilebilir numune sayısını iki katına, deneysel adımlar ve zamanı azaltır.
oksidatif post-translasyonel modi incelemek için başka yöntemler geliştirdik olarak cPILOT esnektir3-nitrotirosin modifiye edilmiş proteinler 14 ve S-nitrozilasyonuyla (oxcyscPILOT) 23 sistein içeren peptidlerin dahil fications. Ayrıca, bir amino asit, seçici bir yaklaşım, sistein cPILOT (cyscPILOT) 17 geliştirdik. Bir üst iyon 11 veya seçici-y 1 -iyon yöntemi 15 MS 3 alıcı raportör iyon girişimi azaltmak ve cPILOT kantitatif hassaslığını arttırabilir. Düşük çözünürlüklü iyon kapanı araçları da 24 ile de çalışabilir elde etme yönteminde MS 3'ün kullanımı, Orbitrap kütle analizörü ile bir yüksek çözünürlüklü bir cihaz gerektirir.
Daha önce, cPILOT bir Alzheimer hastalığı fare modelinde karaciğer proteinleri 16 çalışma için kullanılmıştır. Burada, periphe rolünü incelemek için beyin, kalp ve karaciğer homojenatlan kullanılarak küresel cPILOT analizi gerçekleştirmek için nasıl tarifAlzheimer hastalığında ry. Bu deney biyolojik çoğaltma içermektedir. Çünkü cPILOT çok yönlülüğü, ilgilenen kullanıcılar biyolojik sorunlar ve sistemlerin bir dizi diğer dokuları incelemek için tekniği kullanabilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
cPILOT fazla 12 farklı numune eş zamanlı olarak ölçülmesini sağlar. peptidlerin N-terminali ve hem de lizin kalıntılarının başarılı etiketleme sağlamak amacıyla, reaksiyonların her set için doğru pH değerine sahip olması ve peptit etiketleme için ilk dimetilasyon reaksiyonu gerçekleştirmek için zorunludur. N-ucunda seçici dimetilasyon (± 0.2) ~ 2.5 bir pH değerine sahip olması ile gerçekleştirilir. Bu lisin üzerindeki amino gruplarının pKa farklılıklarını ve N-terminali kullanılmas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar RASR için Pittsburgh Başlangıç Fon Üniversitesi ve NIH, NIGMS R01 hibe (GM 117191-01) kabul eder.
Materials
| Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13 C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) – 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC – Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | – | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | – | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient. |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a ph meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of ph buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand ph buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
References
- Ong, S. -. E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Koehler, C. J., Arntzen, M. &. #. 2. 1. 6. ;., de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
- Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, . From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , (1998).
- Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
- Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
- Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
- Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS – Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
- Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
- Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
- Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
- Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer’s disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
