Sütunlar ve Katmanlar dendritik Morfoloji Analizi
Summary
Burada, sütunlar ve katmanlar halinde Drosophila medulla nöronların dendritik yönlendirmesini nasıl analiz edileceğini göstermektir. iş akışı, izleme referans sütun dizisine dendritik milleri tescili için ve 3 boyutlu uzayda dendritik yapıların analizi için görüntü kalitesi ve hesaplama araçlarını geliştirmek için bir çift görünümü görüntüleme tekniği içerir.
Abstract
Böyle sinek optik loblar ve omurgalı korteks gibi merkezi sinir sistemi, birçok bölgesinde, sinaptik devreler gelişmiş hayvanlarda geliştirme ve bilgi işleme sırasında beyin kablolama kolaylaştırmak için katmanları ve sütunlar halinde düzenlenir. Belirli katmanlarda tip spesifik desen ayrıntılı dendritler postsinaptik nöronlar uygun presinaptik terminalleri ile sinaps için. Uçucu medulla nöropil 10 katman ve yaklaşık 750 sütun oluşmaktadır; her sütun bir tip spesifik biçimde afferentleri bazı 7 tip aksonal terminalleri ile maç medulla nöronların 38 üzerinde türleri, dendritler tarafından innerve edilir. Bu rapor görüntüye prosedürleri ayrıntıları ve medulla nöronların dendritler analiz. iş akışı üç bölümden oluşmaktadır: (i) çift görüntüleme görüntüleme bölümü dendritler bir yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu görüntü içine dik yönlerde toplanan iki konfokal görüntü yığınları birleştirir; (Ii) dendrit izleme ve kayıt bölümü dendritik izleri3D milleri ve referans sütun dizisine dendritik izlerini kaydeder; (Iii) dendritik analiz bölümü dendritik milleri tabaka özel sonlandırma ve düzlemsel projeksiyon yönü de dahil olmak üzere sütun ve katmanlar, açısından dendritik desenleri analiz ve dendritik dallanma ve sonlandırma frekanslarının tahminleri türemiştir. protokoller matris laboratuvar dilinde açık kaynak MIPAV (Tıbbi Görüntüleme İşleme, Analiz ve Görselleştirme) platformu ve özel toolbox üzerine inşa özel eklentileri kullanmaktadır. Birlikte, bu protokoller hücre türlerini tanımlamak için, ve mutantlar kusurları tespit etmek, katmanlar ve sütunlarda Drosophila medulla nöronların dendritik yönlendirme analiz etmek tam bir iş akışı sağlar.
Introduction
gelişimi sırasında, karmaşık ama basmakalıp dallı desenleri nöronlar ayrıntılı dendrit kendi presinaptik ortakları ile sinaps oluşturur. Dendritik dallanma desen nöronal kimlik ve işlevleri ile ilişkilidir. dendritik karmaşıklığı ve saha boyutları giriş numarasını yöneten dallanma sırasında dendritik milleri yerleri, aldıkları presinaptik girdilerin türünü belirlemek. Böylece, dendritik morfolojik özellikleri sinaptik bağlantı ve nöronal hesaplanması için kritik belirleyicidir. Böyle sinek optik loblar ve gözdeki gibi karmaşık beyinleri, birçok bölgesinde, sinaptik devreler bilgi işlem 1, 2 kolaylaştırmak için sütun ve katmanlar halinde organize edilir. Böyle bir sütun ve katman organizasyonda, farklı bir yöntem proje akson presinaptik nöronlar belirli bir katmana (sözde katman özel hedefleme) sona erdirme ve düzenli bir iki boyutlu bir dizi oluşturmak için (yani-called topografik harita), postsinaptik nöronlar belirli katmanlarında uygun boyutlarda dendrit uzatmak ise doğru tip ve sayıları presinaptik girişler almak için. Katmanlara ve sütunlara hedefleme aksonal iyi 3, 4 çalışılmıştır olsa da, çok daha az dendritler belirli katmanlara yönlendirilir ve doğru presinaptik ortaklarla 5 ile sinaptik bağlantıları oluşturmak üzere açık alanları uygun genişletmek boyutlandırılır nasıl bilinir. görüntüleme ve katmanlar ve sütunlar hedefleyen nicel dendritik zorluk sütunlu ve lamine beyin yapılarında dendritik gelişim çalışma engellemiştir.
Drosophila medulla nöronlar sütunlar ve katmanlar halinde dendritik yönlendirme ve devre düzeneğinin çalışmak için ideal bir model vardır. Sinek medulla neuropil 3D 10 katmanları kafes ve yaklaşık 750 sütun olarak düzenlenmiştir. Her sütun p dahil afferentleri bir dizi, innerve edilirolan aksonal terminaller katman özgü moda 6 topografik haritalar oluşturan L5, – hotoreceptors R7 / R8 ve lamina nöronlar L1. Medulla nöronların yaklaşık 38 çeşit bu afferentleri 7 girdileri almak için her medulla sütun ve belirli katmanlarda ve uygun alan boyutlarıyla ayrıntılı dendritler mevcuttur. medulla sinaptik devreler elektron mikroskobik düzeyde yeniden inşa edilmiştir; böylece, sinaptik ortaklıklar iyi 8 7 kurulur. Ayrıca, medulla nöronların çeşitli etiketleme genetik araçlar 9, 10, 11 mevcuttur. transmedulla üç tip (Tm) nöronlar (Tm2, Tm9 ve TM20) inceleyerek, daha önce iki hücre türüne özgü dendritik özelliklerini belirledik: (i) Tm nöronlar ya ön veya arka yönde dendritler proje (düzlemsel projection yönü), hücre tipine bağlı olarak ve (ii) medulla nöronlarının dendritleri hücre türüne özgü bir şekilde (tabakaya özgü sonlandırma) 12 belirli medulla tabakalarını sonlanır. tabaka ve kolon ipuçlarına Tm yanıtları bozan mutasyonlar bu niteliklerin farklı yönlerini etkileyen ise düzlemsel projeksiyon yönü ve katman özgü sonlandırma, Tm nöronların bu üç tip ayırt etmek için yeterlidir.
Burada, sütunlar ve katmanlar (Şekil 1) Drosophila medulla nöronların dendritik desenlendirme incelemek için tam bir iş akışı sunuyoruz. İlk olarak, iki konfokal görüntü birleştirmek için özelleştirilmiş bir yazılım kullanan bir çift görünümü görüntüleme yöntemi, yüksek kaliteli izotropik görüntüleri oluşturmak için yığınlarının göstermektedir. Bu yöntem, süper çözünürlük mikroskobu başvurmadan, dendritik dalların güvenilir izleme izin yüksek kaliteli görüntüler oluşturmak için sadece konvansiyonel konfokal mikroskopi gerektirir böyle birs STED (Uyarılmış Emisyon tükenmesi) veya yapısal aydınlatma. İkincisi, biz dendritik milleri izlemek için ve bir referans sütun dizisi elde edilen nörit izlerini kayıt için bir yöntem mevcut. Üçüncü olarak, dendritik dallanma ve sonlandırma frekanslar için tahmin yürütülürken yanı sıra, düzlemsel projeksiyon yönü ve dendritler tabaka özgü fesih hakkında bilgi ayıklamak için hesaplama yöntemleri göstermektedir. Birlikte, bu yöntemler, 3D, dendritik morfolojileri göre hücre tiplerinin sınıflandırılması dendritik desen karakterizasyonu ve mutant potansiyel kusurların belirlenmesine izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, nasıl görüntü ve Drosophila medulla nöronların dendritik milleri analiz göstermektedir. Birinci bölüm, çift görüntüleme görüntüleme, yüksek çözünürlüklü görüntü yığını haline dekonvulasyon ve iki görüntü yığınlarının kombinasyonunu açıklar. İkinci bölüm, dendrit izleme ve kayıt, referans sütun dizisine medulla nöronların Dendritlerin izleme ve kayıt açıklar. Üçüncü bölüm, dendritik analizi, dendritik kalıpları analiz etmek için özel komut kulla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenen, Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi (C-HL hibe HD008913) Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü ve Bilgi Teknolojileri Merkezi (PGM, NP, ESM ve MM).
Materials
| Software | |||
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | version 16.05 | for image deconvolution (https://svi.nl). commercial software |
| MIPAV | version 7.3.0 | for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/.). freeware | |
| MIPAV plugin: PlugInDrosophilaRetinalRegistration.class | freeware | ||
| MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandardColumnRegistration.class | freeware | ||
| Imaris | Bitplane | for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com). commercial software | |
| Vaa3D | for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/). freeware | ||
| Matlab | Mathworks | R2014b | for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com). commercial software |
| Matlab toolbox: TREES1.14 | v1.14 | for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html). freeware | |
| Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox | v1.0 | for calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Sample files | |||
| SWC file definition | http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html | ||
| The codes and sample files for image combination and registration | https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration | ||
| Reference point example | https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=1471880596000&api=v2 | ||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Computer system | |||
| MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later | 3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal) | ||
| Optional: Quadro4000 (or above) graphic card | Nvidia | for stereographic visualization of dendrites. | |
| Optional: NVIDIA 3D vision2 | Nvidia | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html | |
| Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2 | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html | ||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Reagents for imaging | |||
| 24B10 antibody | The Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
| GFP Tag Antibody | Thermofisher Scientific | G10362 | |
| Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermofisher Scientific | A11034 | |
| Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568 | Thermofisher Scientific | A21124 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mounting Clay | Fisher | S04179 | |
| 70% glycerol in 1X PBS | |||
| Cover glasses, high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9000-000 |
References
- Kaas, J. H. Topographic maps are fundamental to sensory processing. Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).
- Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).
- Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. CSH Perspect Biol. 2 (3), a001743 (2010).
- Clandinin, T. R., Feldheim, D. A. Making a visual map: mechanisms and molecules. Curr Opin Neurobiol. 19 (2), 174-180 (2009).
- Luo, J., McQueen, P. G., Shi, B., Lee, C. H., Ting, C. Y. Wiring dendrites in layers and columns. J Neurogenet. 30 (2), 69-79 (2016).
- Meinertzhagen, I. A., Hanson, T. E. . The development of the optic lobe. In The Development of Drosophila melanogaster. , 1363-1491 (1993).
- Takemura, S. Y., et al. A visual motion detection circuit suggested by Drosophila connectomics. Nature. 500 (7461), 175-181 (2013).
- Takemura, S. Y., et al. Synaptic circuits and their variations within different columns in the visual system of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), 13711-13716 (2015).
- Gao, S., et al. The neural substrate of spectral preference in Drosophila. Neuron. 60 (2), 328-342 (2008).
- Karuppudurai, T., et al. A hard-wired glutamatergic circuit pools and relays UV signals to mediate spectral preference in Drosophila. Neuron. 81 (3), 603-615 (2014).
- Strother, J. A., Nern, A., Reiser, M. B. Direct observation of ON and OFF pathways in the Drosophila visual system. Curr Biol. 24 (9), 976-983 (2014).
- Ting, C. Y., et al. Photoreceptor-derived activin promotes dendritic termination and restricts the receptive fields of first-order interneurons in Drosophila. Neuron. 81 (4), 830-846 (2014).
- Ting, C. Y., et al. Tiling of R7 axons in the Drosophila visual system is mediated both by transduction of an activin signal to the nucleus and by mutual repulsion. Neuron. 56 (5), 793-806 (2007).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
- Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: the input terminals to the medulla. J Comp Neurol. 509 (5), 493-513 (2008).
- Takemura, S. Y., et al. Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway. Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Wu, Y., et al. Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy. Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).
- Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. Automated analysis of NeuronJ tracing data. Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
- Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. JASA. 53, 457-481 (1958).
