여기서, 우리는 96 웰 세포 배양 접시에 반 처리량 세포 이동 분석을 수행 할 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 셀 단층에 일관성 스크래치 상처를 만들 수있는, 빠르고 간단하고 경제적 인 방법이다.
Abstract
셀 마이그레이션 / 분석 부상은 세포 이동 및 혈관 신생 및 종양 전이 등의 생물학적 과정을 공부하기 위해 일반적으로 사용되는 방법이다. 이 분석에서, 세포가 합류 단층을 형성하기 위해 재배 및 기계적 상처는 장치와 긁힘에 의해 생성된다. 다음에 무 결함 영역을 향해 세포의 이동 속도는 촬상에 의해 모니터링 될 수있다. 우리 8 채널 기계적 wounder은 세포 이동 분석법과 관련된 대부분의 문제를 해결하도록 설계된다. 첫째, 우리의 wounder 쉽게 고압 증기 멸균 또는 일반적인 소독제로 살균 할 수있다. 둘째, 개별 조절 핀도 선명하고 재현성 상처가 생성 될 수 있도록, 세포 배양 플레이트에 접촉 허용한다. 셋째, wounder 양측의 안내 바는 각각의 웰에서 일관된 상처 위치를 보장한다. 더 wounder의 더 나은 핸들링을 제공 할뿐만 아니라 크로스 contaminat을 최소화하기 위해 부상에 대한 일회용 플라스틱 피펫 팁의 사용이온. 결론적으로, 우리 셀 wounder은 표준 96 웰 배양 접시를 사용하여 세포 이동 분석을 수행하기위한 사용자 친화적이고 재생 가능한 장치 연구를 제공 할 수있다.
Introduction
세포 이동은 배아 발생, 신경, 혈관 신생, 창상 치유, 점막 수리, 정상적인 발달 및 질병 상태 하에서 1 상피 간엽 – 천이 같은 세포 과정에서 중요한 역할을한다. 이것은 시그널링 분자 상호 작용, 세포 편광 세포 골격 재구성 매트릭스 리모델링 막 돌기 동적 세포 – 세포 부착 2 변조 등 다양한 인터페이스 및 세포 내 사건의 조정을 포함하는 복잡한 과정이다. 세포 이동을 연구함으로써, 세포 이동과 관련된 생화학 적 경로를 선도 화학 또는 생체 분자의 발견 및 확인을 결정할 수있다. 이러한 기본적인 공정은 이러한 질병 치료 약물 표적 같은 다양한 애플리케이션을위한 프록시로서 유리하게 사용될 수있다.
상처 분석법은 세포 이동 분석 (3)의 하나이다. 여기서,셀들의 각각의 샘플은 부분적으로 셀 영역을 덮는 마이그레이션하는 무 결함 영역을 생성하기 위해 기계적인 방법에 의해 제거 될 것이다. 특정 시점에서 회수의 비율을 모니터링한다. 샘플의 많은 수를 처리 할 때, 이러한 샘플 내에서 실험 비용 및 교차 오염 등의 문제가 문제가 될 수 있습니다. 많은 상용 도구와 분석은 세포 이동 4,5,6을 연구 할 수 있지만, 그들 중 많은 사람들이 비싸고 복잡한 장비가 필요하고 개선이 여전히 필요하다. 이러한 이유로, 8 채널 기계적 셀 wounder (도 1)가 개발되고있다.
우리 8 채널 기계적 셀 wounder은 상술 한 문제점을 해결하기에 몇몇의 고유 특징을 포함하고있다. 이것은 96- 웰 배양 플레이트 형식으로 분석 부상 / 세포 이동을 수행 할 수있는 유연성을 제공한다. 조정 번지iding 바 설계는 스크래치 영역을 각 웰의 중앙에 위치되는 것을 보장한다. wounder는 배양 접시의 다양한 브랜드에 적용되도록 또한, 가이드 바의 높이를 조정할 수있다. 마지막으로, 상처 조절 핀 디자인과 동시에 재현성 상처 (7, 8)을 달성하기 위해 배양 접시 표면과 피펫 팁의 짝수 접촉 할 수있다.
Protocol
Wounder의 부품 1. 소개 (그림 1) 동일한 거리에있는 상처 핀을 고정하여 핀 홀더를 준비합니다. 피펫 팁을 잡고 위아래로 조절 상처 핀을 이동하여 팁 높이를 조정합니다. 96- 웰 배양 플레이트의 다른 브랜드의 조절, 안내 막대를 장착하고 상처 면적이 고정 된 위치에있을 것을 보장한다. 육각 나사를 조여 조정 상처 핀을 고정합니다. 양단에 육각 소켓 헤드 캡을 조여 위치에 ?…
Representative Results
이 8 채널 기계적 wounder은 세포 이동 분석을 수행하기 위해 세포 단층을 긁어 구성된다. 그것은 특별한 교육을받지 않은 분 안에 96 웰 플레이트 세포 긁힘 분석을 수행 할 수있는 사용자 친화적 인 장치입니다. 이 wounder 약 600 ㎛의 균일 한 폭과 날카로운 가장자리 세포 단층에 감긴 영역을 도입 할 수있다 (도 5 및도 6). 상처의 폭은 피펫 팁의 브랜?…
Discussion
우리의 세포 wounder는 기존의 세포 이동 분석의 문제를 해결하는 몇 가지 독특한 기능을 가지고 있습니다. 8 채널 기계적 셀 wounder은 고압 증기 멸균에 의해 멸균 될 수있는 긴 수명과 높은 등급의 스테인레스 (스틸 304)로 이루어진다. 시판 96- 웰 배양 판의 거의 모든 상업용 브랜드 때문에 조정 안내 막대이 기계적 세포 wounder 함께 사용될 수있다. 조정 안내 바의 설계는 찰 영역을 각 웰의 중앙에있?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 wounder의 프로토 타입을 만드는 씨 탐 포 렁 씨 웡 치 킨과 기술 능력에 대한 과학 학부 워크샵의 기술 직원, 홍콩 침례 대학과 조언을 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
96-well cell culture plate
Nunc
167008
Other brands of 96-well cell culture plate can also be used
P10 pipette tips
Axygen
301-03-051
Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound
Wounder
R&P Technology Limited
Medium 199
Sigma
M2520-1L
For cell culture of human umbilical vein endothelial cells.
Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Fetal bovine serum
Gibco
26140079
For cell culture of human umbilical vein endothelial cells.
Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Penicillin/Streptomycin
Gibco
15140122
For cell culture of human umbilical vein endothelial cells.
Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa
Sigma
H3393
For cell culture of human umbilical vein endothelial cells.
Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Gelatin from bovine skin
Sigma
G9391
For cell culture of human umbilical vein endothelial cells.
Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Poon, P. Y., Yue, P. Y. K., Wong, R. N. S. A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate. J. Vis. Exp. (121), e55411, doi:10.3791/55411 (2017).