En anordning för utförande Cell Migration / Sårläkning i en platta med 96 brunnar

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra en cellmigrationsassay halv hög genomströmning på en 96-brunnars cellodlingsplatta. Detta protokoll är en snabb, enkel och ekonomisk metod att skapa enhetliga skrap sår på ett cellmonolager.

Abstract

Migreringen cell / sårbildning analys är en vanligt använd metod för att studera cellmigrering och andra biologiska processer, såsom angiogenes och tumörmetastas. I denna analys odlas celler till att bilda ett sammanflytande monoskikt och ett mekaniskt sår skapas genom att skrapa med en enhet. Då migreringshastigheten för cellerna mot blottlagda området kan övervakas genom avbildning. Vår 8-kanals mekanisk wounder är utformad för att ta itu med de flesta av de problem som är förknippade med analyscellmigration. För det första kan vår wounder lätt steriliseras genom autoklavering eller med vanliga desinfektionsmedel. För det andra tillåter de individuella justerbara stift även kontakt med cellodlingsplatta så att man kan skapa skarpa och reproducerbara sår. För det tredje, de vägledande barer på båda sidor av wounder säkerställa konsekvent sårskada position i varje brunn. Användningen av engångsplast pipettspetsar för skadade kan ytterligare ge bättre hantering av wounder samt för att minimera kors contaminatJon. Sammanfattningsvis kan vår cell wounder ge forskare en användarvänlig och reproducerbar anordning för att utföra analysen av cellmigration genom att använda standard 96-brunnars odlingsplatta.

Introduction

Cell migrationen spelar en viktig roll i cellulära processer, såsom embryogenes, neurogenes, angiogenes, sårläkning, mucosal reparation, epitelceller-mesenkymala-övergångar vid normal utveckling och sjukdomssituationen ^en. Det är en komplicerad process som innebär samordning av många inter- och intra-cellulära händelser, inklusive signalmolekyl interaktioner, cell polarisering, cytoskelettala omorganisation, matrix remodeling, membran utsprång och dynamisk cell-cell adhesion modulering ^2. Genom att studera cell migration, kan upptäckten och validering av kemikalier eller biomolekyler som leder till cellrörelse och dess relaterade biokemiska vägar bestämmas. Denna grundläggande process kan med fördel användas som en proxy för olika tillämpningar, såsom behandling av sjukdomar och läkemedel inriktning.

Den såra analysen är en av de cellmigrationsanalyser ^3. Här, enindividuella prov av celler kommer att delvis avlägsnas på mekanisk väg för att producera en blottlagda område där cellerna kommer att migrera för att täcka området. Procentandelen av återhämtning vid en viss tidpunkt kommer att övervakas. Vid hantering av stort antal prover, kan frågor som den experimentella kostnader och korskontaminering inom proverna vara problematiskt. Även om många kommersiella verktyg och analyser är tillgängliga för att studera cell migration ^{4, 5, 6,} många av dem krävs dyr och avancerad utrustning och fortfarande behövs förbättringar. Av dessa skäl är en 8-kanals mekanisk cell wounder (Figur 1) utvecklats.

Vår 8-kanals mekanisk cell wounder har införlivat ett flertal unika egenskaper för att lösa de ovan nämnda problemen. Det ger flexibilitet att utföra cellmigration / såra analyser i 96-brunnars odlingsplattformat. Den justerbara guIding bar design säkerställer att repa området är i den centrala positionen av varje brunn. Dessutom kan höjden på de vägledande barer justeras så att wounder är tillämpbar för olika märken av odlingsplattor. Slutligen, den justerbara såra stift konstruktion möjliggör en jämn kontakt pipettspetsarna med odlingsplatta ytan för att uppnå samtidig och reproducerbar såra ^{7, 8.}

Protocol

1. Introduktion till de delar av den Wounder (Figur 1) Förbered stifthållaren genom att fastställa skadades stift på lika avstånd. Håll pipettspetsarna och justera spetshöjden genom att flytta de justerbara sårskada stiften upp och ner. Montera den justerbara styr-bar på olika märken av 96-brunnsodlingsplattor och se till att såra området är i ett fast läge. Fäst justerbara såra stift genom att dra åt sexkantskruven. Fäst leds bar på plats genom att dra åt hex socket he…

Representative Results

Detta 8-kanals mekanisk wounder är konstruerad för att skrapa en cell monoskikt för att utföra analysen cellmigration. Det är ett användarvänligt enhet som kan utföra cell repa analyser in 96-brunnsplattor i mindre än en minut utan speciell träning. Denna wounder kan införa lindade områden på cellmonoskikt med en enhetlig bredd på omkring 600 | j, m och med skarpa kanter (fig 5 och 6). Bredden av såren beror på vilket märke av pipettspet…

Discussion

Vår cell wounder har flera unika egenskaper för att lösa problemen med traditionella cellmigrationsanalyser. Den 8-kanals mekanisk cell wounder är tillverkad av högvärdigt rostfritt stål (stål 304) med en lång livslängd som kan steriliseras genom autoklavering. Nästan alla kommersiella märken av 96-brunnars odlingsplattor som finns på marknaden kan användas med denna mekaniska cell wounder på grund av den justerbara styraxel. Utformningen av den justerbara styraxel säkerställer också att sprätta områ…

Materials

96-well cell culture plate	Nunc	167008	Other brands of 96-well cell culture plate can also be used
P10 pipette tips	Axygen	301-03-051	Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound
Wounder	R&P Technology Limited
Medium 199	Sigma	M2520-1L	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Fetal bovine serum	Gibco	26140079	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3393	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Gelatin from bovine skin	Sigma	G9391	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.