Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.
Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.
Det anslås, at planter producerer over 200.000 forskellige typer af kemiske forbindelser 1. Kun et mindretal af disse forbindelser synes at spille en rolle i planternes primære stofskifte, som brændstoffer vækst og reproduktion; flertallet er såkaldte sekundære metabolitter. På trods af deres navn, sekundære metabolitter er ofte afgørende for planter overlevelse og reproduktion, da de tjener til at tiltrække bestøvere eller forsvare planten mod patogener og planteædere 1.
Glucosinolater er en meget forskelligartet gruppe af sekundære metabolitter, der er blevet undersøgt i over 150 år 2. Til dato har mere end 130 strukturelt forskellige glucosinolater blevet identificeret 3. I store træk kan glucosinolater underinddeles i forskellige klasser baseret på aminosyren hvorfra de syntetiseres. Indolglucosinolater fx syntetiseres ud fra aminosyrentryptophan, hvorimod phenylalanin tilvejebringer grundskelet til syntese af aromatiske glucosinolater 4. Inden klasser, der er en høj grad af strukturel diversitet, som er tilvejebragt gennem sekventielle kædeforlængelse trin i den biosyntetiske pathways, såsom i klassen af alifatiske glucosinolater, eller ved sidekædemodifikationer (f.eks hydroxylering) 4, 5. En glucosinolat plantearter kan indeholde op til 37 forskellige glucosinolater tilhører forskellige strukturelle klasse 6. Selvom plantearter har typiske glucosinolat profiler, er intraspecifikke variation for de typer af glucosinolater ofte findes blandt individer og populationer 6, 7. Intakte glucosinolater gemmes i vakuoler af planteceller og kan findes i enhver overjordiske eller belowground organ 7, <sup class = "xref"> 8, 9. Ved celle brud (fx ved herbivory), er glucosinolater frigivet og blandes med enzymet myrosinase, modregning en sennepsolie bombe 10. På grund af aktiviteten af myrosinase, og afhængigt af strukturen af glucosinolat, reaktionsbetingelserne, og tilstedeværelsen af modificerende enzymer, er forskellige bidende, giftige eller skadelige forbindelser dannes, såsom nitriler og (iso) thiocyanater 11. Reaktionsprodukterne har høje biologiske aktiviteter; for eksempel, de tjener som afskrækningsmidler af generalist insekter planteædere 12. Arveligheden og biosyntetiske veje for glucosinolater er godt undersøgt, hovedsagelig på grund af deres betydning for planteædere og patogen modstand, deres værdi som smagskomponenter i sennep og kål, og deres negative (progoitrin) og positive (glucoraphanin) virkninger på menneskers sundhed 5, </sup> 13, 14.
På grund af den store interesse for glucosinolater som biologisk aktive forbindelser, udvinding og detektionsmetoder baseret på omvendt fase højtryks-væskekromatografi (HPLC) udstyret med ultraviolet (UV) eller fotodiodearray (PDA) detektorer er blevet almindeligt anvendt siden 1980'erne 15 . Baseret på denne metode, De Europæiske Fællesskaber udsendte en standardprotokol, der blev testet og valideret i flere laboratorier til analyse af glucosinolater i oliefrø (Brassica napus, raps-, Canola 16). Andre tilføjet til denne metode (fx ved at bestemme yderligere reaktionsfaktorer for glucosinolater, der ikke er til stede i raps) 17. Trods den øgede tilgængelighed af væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) platforme og high-throughput protokoller for glucosinolat analyse 18 <sup>, 19, er den oprindelige HPLC-UV / PDA metode stadig meget brugt af videnskabsmænd. De væsentligste årsager er, at denne metode er ligetil, omkostningseffektiv, og relativt tilgængelig for laboratorier uden en omfattende kemisk-analytisk viden infrastruktur. At tjene dette samfund, vi her detalje protokollen til udvinding af glucosinolater fra plantematerialer og analyse af deres desulfo-former med HPLC-PDA.
De største fordele ved denne etableret og udbredte metode er, at det er robust, snarere ligetil, og relativt lave omkostninger per prøve. Det meste af det nødvendige udstyr til udvinding og analyse bør være tilgængelige i en standard laboratorium eller kan være selv-bygget, med undtagelse af HPLC-PDA. En anden fordel er, at desulfoglucosinolates opløst i vand, er kemisk helt stabile, når opbevares køligt og i lufttætte (HPLC) hætteglas, så ekstrakterne kunne let overføres til HPLC-analyse andetsteds. I modsætning til LC-MS-platforme, som kræver specialiserede uddannelse og omfattende hands-on erfaring til styring af software og analysere dataene, HPLC-UV / PDA'er kan nemt løbe efter en kort træningsperiode. Dette reducerer ikke blot omkostningerne ved proceduren, men også gør denne metode mere tilgængelig for en bred vifte af forskere, herunder studerende.
Generelt, når de procedurer, der er beskrevet ovenfor følges carefully, skulle opstå nogle problemer. I almindelighed glucosinolat toppe meget godt adskilt i kromatogrammet. Hvis dette ikke er tilfældet, kan gradienten programmet tilpasses ved at reducere stigningstakten i acetonitril i eluenten. Alternativt bygning i en ny pre-søjle (200-500 injektioner) eller kolonne (1.500 -2000 injektioner) kan løse problemet. Indimellem kan kromatogrammer af enkelte prøver i et parti viser meget små eller ingen toppe. Dette er normalt på grund pipetteringsfejl ved tilsætning af sulfatase (fx en kolonne er blevet sprunget eller sulfatase var ikke korrekt skyllet i kolonnen). Alternativt kan koncentrationen glucosinolat i de eksperimentelle materialer har været lavere end forventet, og for lidt materiale blev anvendt til ekstraktionen. Hvis det sidste er tilfældet, kan injektionsvolumen øges til 100 pi eller en nøjagtig portion (f.eks, 800 pi) af ekstrakten kunne koncentreres. Sidstnævnte kan opnås ved fryse- tørreing ekstrakten, opløsning af resten i et mindre volumen (f.eks 100 pi) af vand, og reinjecting bruger samme reference kurve. I beregningerne for den oprindelige koncentration af ekstrakt, bør tallene ganges med fortyndingsfaktoren. Hvis dette ikke løser problemet, skal materialerne udtrækkes igen bruge mere udgangsmateriale. Hvis dette er mere end 100 mg, bør volumenet af ekstraktionsmidler og størrelsen af rørene justeres proportionalt at opretholde ekstraktionseffektiviteten.
En yderligere fordel er, at denne fremgangsmåde er blevet godt valideret. Det er fordi det er blevet beskrevet som en standard metode til kvantificering af glucosinolater i raps, hvor procedurerne og nøjagtighed blev bekræftet i flere laboratorier 16. Desuden den genetiske baggrund, biosyntese og biologiske funktioner af glucosinolater er udsat for intens forskningsindsats, i model plantearter Arabidopsis thaliana bl.a. 4, 6, 12. Derfor er mange respons faktorer for den nøjagtige kvantificering af desulfoglucosinolates i relation til sinigrin veldefinerede og offentligt tilgængelig 15,17. Selvom LS-MS-baserede protokoller er mere high-throughput, mere følsomme, og er i stand til (forsøgsvis) identificere glucosinolater for hvilke der ikke standarderne findes 18, 19, 20, manglen på universelle reaktionsfaktorer for LC-MS begrænser eksakt kvantificering af glucosinolat koncentrationer 18. Desuden er disse metoder sædvanligvis ikke omfatter en frysetørringstrin, og mængden af vand i den friske plantemateriale er forsvundet i beregningerne, hvilket gør præcis kvantificering vanskelig. Endelig fordi vores ekstraktion metode indebærer en kolonne-baseretoprensning og koncentrering trin kan det også anvendes på "snavsede" prøver med lave koncentrationer af glucosinolater, såsom jord 21.
Sammenlignet med LC-MS-baserede metoder, der normalt ekstrakt frisk frosne materialer, anvender plader med 96 brønde til ekstraktion, og ikke omfatter en sulfatase trin 18, 19, vores metode er relativt tidskrævende og arbejdskraft intens. Med kolonnen stativer er beskrevet i dette papir, kan en enkelt person ekstrakt ca. 100-150 prøver på én dag. Eluering (næste dag), frysetørring (natten over), og re-opløsning kan finde sted inden for de følgende to dage. Med en automatiseret HPLC injektor, en løbetur og ligevægt tid på 40-45 min pr injektion, og ingen uforudsete begivenheder, ville det tage 3-4 dage at erhverve data til dette prøvesæt. Når HPLC software muliggør automatisk kvantificering baseret på sinigrin kurve, en manuel kontrol af kromatogrammerne og peak opgaver for 100 prøver kan kun tage en anden 1 eller 2 timer før data kan bruges til statistiske analyser.
På trods af den øgede tilgængelighed af glucosinolat standarder, kun en lille brøkdel af de mere end 130 kandidater kan i øjeblikket kommercielt købt. Men med nogle få referencer for hver af de biosyntetiske klasser; adgang til litteraturdatabaser præciserer de forbindelser, som tidligere fundet i plantearter (f.eks Fahey et al. 22); grundlæggende viden om kromatografiske principper såsom logikken i eluotropic serier (fx for et stigende antal Cs på sidekæden i alifatiske forbindelser, figur 3 og 4); og validering af de enkelte prøver på LC-MS 19 eller isolerede glucosinolater på NMR 23, kan man nemt overvinde denne begrænsning. De fleste protokoller for glucosinolater analyser anvende interne referencekurver(Dvs. en vis koncentration til udvinding af sinigrin eller sinalbin til ekstraktionsopløsningsmidlet 16, 17, 19). Principielt interne referencedata kurver er mere hensigtsmæssigt at korrigere for de enkelte prøve behandlingsfejl og dermed teoretisk give en højere præcision. På trods af denne fordel, foretrækker vi at bruge en fem-punkts ekstern reference kurve, som vi ofte analysere forskellige vilde arter, hvoraf nogle indeholder høje niveauer af sinigrin (fx Brassica nigra 24) eller sinalbin (f.eks Sinapis alba 25), den to glucosinolat referencer for hvilke responsfaktorer er tilgængelige. Desuden tilføjer interne standarder til hver prøve øger udgifterne til analyserne, som high-grade glucosinolater referencenormaler er normalt ret dyrt.
Som konklusion på trods af de tidskrævende trin, denne protokolgiver en enkel og tilgængelig metode til at udvinde og kvantificere glucosinolater i planter prøver. Imidlertid er det vigtigt at overveje, at glucosinolatniveauer selv er kun en indikation af den potentielle biologiske aktivitet, set som det er nødvendigt at reagere med myrosinase, og variation i reaktionsprodukterne kan opstå fra en enkelt glucosinolater 11. Validation assays skal udføres for at bekræfte den biologiske relevans.
The authors have nothing to disclose.
NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University Tübingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).
Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20,864,320 | |
Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
HCL | VWR | 1,090,571,000 | |
Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
(−)-Sinigrin hydrate from horseradish |
Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
Ethanol | VWR | 20,816,298 | |
Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
Glass /wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
2 mL reaction tubes | VWR | 211-2606 | |
Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
Acetonitril super gradient grade | VWR | 83,639,320 | |
Water bath | VWR | 462-5112 | |
Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
Flask 1000 mL | VWR | 215-1595 | |
Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |