Un<em> In Vitro</em> Órgano Cultura Modelo Murino del disco intervertebral
Summary
cultivo de órgano entero del disco intervertebral (DIV) conserva la matriz extracelular nativa, fenotipos de células, y las interacciones celulares-matriz. A continuación se describe un sistema de cultivo IVD utilizando lumbar del ratón y IVD caudales en sus unidades funcionales de la columna vertebral y varias aplicaciones que utilizan este sistema.
Abstract
disco (IVD) degeneración intervertebral es un contribuyente significativo al dolor de espalda baja. El IVD es una articulación fibrocartilaginous que sirve para transmitir y amortiguar las cargas en la columna vertebral. El IVD consiste en una pulposo rica en proteoglicanos núcleo (NP) y un anillo de fibrosis rico en colágeno (AF) insertado por placas extremas cartilaginosas. Junto con las vértebras adyacentes, la estructura de vértebras-IVD forma una unidad columna vertebral funcional (FSU). Estas microestructuras contienen tipos de células únicas, así como matrices extracelulares únicos. cultivo de órgano entero de la FSU conserva la matriz extracelular nativa, fenotipos de diferenciación celular, y las interacciones celulares-matriz. Por lo tanto, las técnicas de cultivo de órganos son particularmente útiles para la investigación de los complejos mecanismos biológicos de la IVD. A continuación, describimos un enfoque de alto rendimiento para el cultivo de toda UFA ratón lumbar que proporciona una plataforma ideal para el estudio de los mecanismos y las terapias de enfermedades para el IVD. Además, describimos saplicaciones everal que utilizan este método de cultivo de órganos para llevar a cabo estudios adicionales incluyendo imágenes microCT contraste mejorado y tridimensionales de alta resolución de elementos finitos modelado de la IVD.
Introduction
El dolor lumbar (LBP) es el factor principal para la discapacidad global y la pérdida de productividad en el lugar de trabajo, y sólo los estadounidenses gastan más de 50 mil millones de dólares en el tratamiento LBP 1. Aunque prevalece, la etiología del dolor lumbar sigue siendo compleja y multifactorial. Sin embargo, el disco intervertebral (DIV) degeneración es uno de los factores de riesgo más importantes para la LBP 2.
El IVD está hecho de tres microestructuras: la fibrosis exterior del anillo (AF), el núcleo interior pulposo (NP), y dos placas terminales cartilaginosas ese sándwich toda la estructura proximal y distal 3. Con el envejecimiento y la degeneración, los componentes IVD cambian estructuralmente, de composición, y mecánicamente 4. Estos cambios incluyen la pérdida de proteoglicanos y la hidratación de la NP, disminución de la altura del disco, y se deterioró competencia mecánica 5. Estas alteraciones sona menudo acompañada de citoquinas que promueven una respuesta inflamatoria, así como los neutrófilos y de la raíz dorsal intrusión ganglio en el espacio articular culminando en una cascada de acontecimientos que conducen a síntomas de dolor lumbar 6.
El estudio de los mecanismos de degeneración IVD es un reto en los seres humanos, ya que a menudo no es posible aislar la causa de la degeneración antes de la aparición de dolor de espalda baja. Por lo tanto, un enfoque reduccionista de simplificar el sistema experimental hasta el órgano IVD permite mecanicista puesta a punto de las variables causales y examinar sus efectos aguas abajo 5. El sistema se reduce a solamente la población celular nativa y que rodea a la matriz extracelular, lo que permite la interpretación directa de los efectos de los estímulos externos sobre la degeneración IVD. Además, el coste más bajo y la escalabilidad de modelos murinos, así como el gran número de animales modificados genéticamente 7, permiten tque la detección rápida de los mecanismos dirigidos degenerativas IVD y terapias potenciales. A continuación, describimos un sistema de cultivo de órganos murino en el que IVD estabilidad celular y tisular se mantiene más de 21 días, con el foco específico dado a patrones homeostáticos, mecánicos, estructurales e inflamatorias las IVD. Usando este método, controlamos cambios funcionales los IVDs' en un modelo de lesión inducida por puñalada 8 para entender los mecanismos detrás de la degeneración del disco. Además, describimos varias aplicaciones de este método de cultivo de órganos para llevar a cabo estudios adicionales incluyendo imágenes microCT contraste mejorado y de alta resolución de modelado tridimensional de la IVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un cultivo de órganos de la murino FSU con énfasis en el seguimiento de los cambios biológicos en el IVD. El mantenimiento con éxito de estos cultivos requiere técnicas estériles cuidadosas. En particular, la disección de los pasos 2.1 a 2.6 y la cultura los pasos 3.1 a 3.6 requieren un cuidado especial para asegurar que se mantengan las condiciones estériles, y estos pasos se debe realizar preferiblemente en una sala de procedimiento aislado con un flujo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Washington Centro de Investigación musculoesqueléticos (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), Mecanobiología Formación Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, y los NIH K01AR069116. Los autores desean agradecer a Patrick Wong por sus contribuciones en la recolección de datos.
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
References
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