bir<em> İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk> Organ Kültürü Modeli
Summary
intervertebral disk (IVD) Whole organ kültür doğal hücre-dışı matrisi, hücre fenotipleri ve hücresel-matriks ilişkilerini kontrol korur. Burada fare bel ve bunların fonksiyonel spinal birimlerinde kaudal IVD'ler ve bu sistemi kullanan birçok uygulamaları kullanarak bir IVD kültür sistemi açıklanmaktadır.
Abstract
İntervertebral disk (IVD) dejenerasyonu, bel ağrısı için önemli bir katkıda bulunmaktadır. IVD iletmek ve omurgasında yükleri azaltacak hizmet veren bir fibrokartilajinöz eklemdir. IVD proteoglikandan zengin nucleus (NP) ve kıkırdak uç plakaları arasında kalan bir kolajen zengin halka fibroz (AF) oluşur. Birlikte komşu vertebralar ile omurlar-IVD yapısı fonksiyonel omurga birimi (ESB) oluşturmaktadır. Bu mikro benzersiz hücre türleri yanı sıra özgün hücre dışı matrisler içerir. FSU Whole organ kültür doğal hücre-dışı matrisi, hücre farklılaşması fenotipleri ve hücresel-matriks ilişkilerini kontrol korur. Bu nedenle, organ kültürü teknikleri IVD karmaşık biyolojik mekanizmaları araştırmak için yararlıdır. Burada, İVG hastalık mekanizmalarını ve terapileri eğitimi için ideal bir platform sağlar bütün bel fare FSUs yetiştirmek için kullanılan bir yüksek verimli bir yaklaşım açıklar. Ayrıca, s tarifkontrastlı microCT görüntüleme ve IVD üç boyutlu yüksek çözünürlüklü sonlu elemanlar modelleme dahil başka çalışmalar yapmak için bu organ kültürü yöntemi kullanan everal uygulamalar.
Introduction
Bel ağrısı (BA) işyerinde küresel sakatlık için önde gelen faktör ve kayıp verimlilik ve Amerikalılar yalnız LBP tedavisi 1 50 milyar doların üzerinde harcama. yaygın olmakla birlikte, bel ağrısı etiyolojisi kompleks ve çok kalır. Bununla birlikte, intervertebral disk (IVD) dejenerasyon LBP 2 için en önemli risk faktörleri arasında yer almaktadır.
IVD üç mikroyapıların meydana gelir: dış halka fibroz (AF), iç çekirdeği pulposus (NP) ve proksimal ve distal olarak 3 bütün yapı sandviç iki kıkırdak omurun. Yaşlanma ve dejenerasyon ile IVD bileşenleri kompozisyonel yapısal değişiklik ve mekanik 4. Bu değişiklikler, NP proteoglikanlar ve hidrasyon kaybı gibi, disk yüksekliği azalması ve mekanik yetkinlik 5 bozulmuştur. Bu değişiklikler şunlardırgenellikle LBP semptomları 6 yol edilen bir olay grubuyla sonuçlanan eklem yeri boşluğuna bir enflamatuvar yanıtı ve aynı zamanda nötrofil ve dorsal kök ganglion girmesini teşvik sitokinler ile birlikte.
bel ağrısı verilmeden önceki dejenerasyon nedenini ortadan kaldırmak için çoğu zaman mümkün değildir, çünkü IVD dejenerasyon mekanizmalarının incelenmesi insanlarda zordur. Bu nedenle, IVD organa aşağı deneysel sistem basitleştirilmesi indirgemeci yaklaşım nedensel değişkenlerin mekanik ince ayarlanmasına izin verir ve bunların bir aşağı akış etkisine 5 incelenmesi. Sistem böylece IVD dejenerasyonu dış uyaranların etkileri doğrudan yorumlanmasını sağlar, ancak doğal hücre nüfusu ve hücre-dışı matrisi çevreleyen, indirgenir. Ayrıca, daha az maliyet ve fare modellerinin ölçeklenebilirlik, aynı zamanda, genetik olarak tadil edilmiş hayvanlar 7 çok sayıda, t izinIVD dejeneratif mekanizmalarla ve potansiyel terapilerin o hızla hedefe yönelik tarama. Burada, IVD hücre ve doku stabilitesi IVD'ler, homeostatik mekanik, yapısal ve inflamatuar desen verilen belirli bir odak ile, 21 gün boyunca muhafaza edildiği bir murin organ kültürü sistemi tarif eder. Bu yöntemi kullanarak, disk dejenerasyonu altında yatan mekanizmaları anlamak için bir bıçak kaynaklı yaralanma modelinde 8 IVD'ler fonksiyonel değişiklikleri izler. Ayrıca, kontrastlı microCT görüntüleme ve IVD üç boyutlu yüksek çözünürlüklü modelleme dahil başka çalışmalar yapmak için bu organ kültürü yönteminin çeşitli uygulamaları açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol IVD biyolojik değişikliklerin izlenmesi üzerinde durularak fare FSU bir organdır kültürünü özetliyor. Bu kültürlerin başarılı bakım dikkatli steril teknikler gerektirir. Özellikle, diseksiyon 2.1-2.6 adımları ve Kültür 3.1-3.6'da steril koşulların korunmasını sağlamak için özel dikkat gerektirir adım, ve bu aşamalar kirleticiler en aza indirmek için bir HEPA hava akışı ile izole edilmiş bir uygulama odasında tercihen yapılmalıdır. Dis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Washington Üniversitesi Kas İskelet Araştırma Merkezi (NIH P30 AR057235), Moleküler Görüntüleme Merkezi (NIH P50 CA094056), mechanobiology Eğitim Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 ve NIH K01AR069116 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar veri toplamada katkılarından dolayı Patrick Wong teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
References
- Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).
- Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5 (6), 1-48 (2003).
- Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13 (3), 131-142 (1995).
- Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20 (24), 2690-2701 (1995).
- Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34 (8), 1431-1438 (2016).
- Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15 (6), 1347-1355 (2015).
- Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
- Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15 (4), 404-413 (2011).
- Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48 (10), 2189-2194 (2015).
- Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
- Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
- O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
- Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
- Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116 (12), (2014).
