Een Rapid Automated Protocol voor Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Dwarsdoorsneden Met behulp van zware keten van myosine Immunohistochemie
Summary
Hier presenteren we een protocol voor snelle spiervezels analyses, welke verbeterde kleuring kwaliteit en daardoor automatisch ophalen en kwantificering van vezelpopulaties door de vrij beschikbare software ImageJ mogelijk maakt.
Abstract
Kwantificatie van spiervezel populaties verschaft meer inzicht in de gevolgen van de ziekte, trauma en verschillende andere invloeden op skeletspier samenstelling. Diverse tijdrovende methoden zijn van oudsher gebruikt om vezelpopulaties studeren op vele terreinen van het onderzoek. Echter, recent immunohistochemische methoden op basis van myosine zware keten eiwitexpressie ontwikkeld te snel alternatief voor meerdere vezeltypes is uit een enkele sectie. Hier presenteren we een snelle, betrouwbare en reproduceerbare protocol voor betere kleuring kwaliteit, waardoor automatisch ophalen van hele dwarsdoorsneden en automatische kwantificatie van vezelpopulaties met ImageJ. Hiertoe zijn ingebed skeletspieren gesneden dwarsdoorsneden, gekleurd met myosine zware ketens kunnen antilichamen met fluorescente secundaire antilichamen en DAPI kleuring van celkernen. Hele dwarsdoorsneden automatisch gescand met diascanner hoge resolutie composiet te verkrijgenfoto's van het gehele monster. Vezels populatie analyses worden vervolgens uitgevoerd om langzame, intermediaire en snelle vezels behulp van een geautomatiseerde macro voor ImageJ kwantificeren. We hebben eerder aangetoond dat deze methode vezelpopulaties betrouwbare wijze identificeren mate van ± 4%. Daarnaast is deze methode minder inter-user variabiliteit en tijd per analyses aanzienlijk van de open source platform ImageJ.
Introduction
Skeletspier samenstelling ondergaat diepgaande veranderingen in fysiologische processen zoals veroudering 1, 2, oefening 3, 4, 5, 6, 7 of pathofysiologische processen zoals de ziekte van 8, 9, 10 of 11 trauma. Vandaar dat een aantal onderzoeksgebieden concentreren op de structurele effecten van deze processen naar functionele veranderingen te begrijpen. Een van de belangrijkste aspecten van het bepalen van de spierfunctie is de samenstelling van de spiervezels. Spiervezels express zware keten (MHC) eiwitten verschillende myosine en worden daardoor geclassificeerd in langzame, tussengelegen of snelle vezels 7, 12, 13 </sup >, 14, 15, 16, 17. Fysiologisch spieren verschillende spiervezels samenstelling afhankelijk van hun functie in het lichaam. Gebruik spiervezels typen, kan vezelpopulaties worden gekwantificeerd aanpassing identificatie van fysiologische of pathofysiologische processen 7, 17. Historisch gezien een aantal tijdrovende methoden toegepast om onderscheid te maken tussen types spiervezels. Hiertoe werden spiervezels geclassificeerd hetzij reactiviteit van myosine ATPase bij verschillende pH-niveaus of spier enzymactiviteit. Aangezien verschillende vezelkwaliteiten niet een enkel kon worden vastgesteld, werden meerdere doorsneden nodig om alle spiervezels te identificeren en toe handmatig kwantificering 14, 16, 17,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. Daarentegen recente publicaties gebruikt immunohistochemie (IHC) tegen myosine zware keten eiwit snel vlek meerdere soorten vezels in één dwarsdoorsneden. Op basis van de voordelen van deze procedure, wordt nu beschouwd als de gouden standaard in de spiervezels populatie-analyse 19, 23, 24. Middels verbeterde IHC kleuringsprotocollen, waren we recent aantonen dat de volledig automatische verwerving van volledige spieren dwarsdoorsneden en daaropvolgende automatische spiervezels kwantificering mogelijk van de open source platform ImageJ. Vergeleken met handmatige kwantificering onze procedure een significant kortere periode (circa 10% van handmatige analyses) nodig per slede terwijl nauwkeurigheid van ± 4% 25 </sup>.
Het algemene doel van deze werkwijze is een snelle, betrouwbare, gebruikersonafhankelijke lijst automatisch spiervezel te kwantificeren geheel rat spieren beschrijven het gebruik van een open source platform. Daarnaast beschrijven we mogelijke modificaties dat het gebruik van andere monsters zoals muizen of menselijke spieren zou toelaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier tonen we een algemeen toegankelijke methode te bestuderen automatisch kwantificeren spiervezel populaties ratten doorsneden door immunohistochemie in een tijd efficiënte manier. Voor reproduceerbaarheid presenteren wij een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving en mogelijke modificaties voor toepassingen in andere soorten niet beschreven in deze studie. Verder bespreken we de voordelen van de werkwijze voorwaarden voor een optimale werking en beperkingen.
Momenteel is een aanta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de christelijke Doppler Research Foundation. We willen graag bedanken Sabine Rauscher van de Core Facility Imaging aan de Medische Universiteit van Wenen, Oostenrijk voor ondersteuning van het gehele project. Primaire antilichamen werden ontwikkeld door Schiaffino, S., verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank, gecreëerd door de NICHD van de NIH en gehouden op de Universiteit van Iowa, Departement Biologie, Iowa City, IA.
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
References
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -. X., Yu, J. -. G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. . Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. c. h. r. i. j. v. e. r. s. -., Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
