Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking
Summary
Dit protocol kan een onderzoeker te isoleren en karakteriseren weefsel-ingezeten macrofagen in diverse hallmark ontstoken weefsels dieet-geïnduceerde modellen van metabolische wanorde is onttrokken.
Abstract
Obesitas bevordert een chronische inflammatoire staat die is grotendeels gemedieerd door weefsel-ingezeten macrofagen evenals monocyt-afgeleide macrofagen. Dieet-geïnduceerde obesitas (DIO) is een waardevol model bij het bestuderen van de rol van macrofaag heterogeniteit; voldoende macrofaag isolatie zijn echter moeilijk te verwerven van ontstoken weefsels. In dit protocol, duidelijk naar voren komt de isolatie stappen en de nodige richtlijnen voor troubleshooting afgeleid van onze studies voor het verkrijgen van een geschikt bevolking van weefsel-ingezeten macrofagen van muizen na 18 weken van hoog-vet (HFD) of hoog-vet/hoog-cholesterol) HFHCD) dieet interventie. Dit protocol is gericht op drie hallmark weefsels in zwaarlijvigheid en atherosclerose, met inbegrip van de lever en wit vetweefsel (WAT) de aorta bestudeerd. We benadrukken hoe dualistische gebruik van stroom cytometry kan bereiken een nieuwe dimensie van isolatie en karakterisatie van weefsel-ingezeten macrofagen. Een fundamentele deel van dit protocol adressen de fijne kneepjes onderliggende weefsel-specifieke enzymatische spijsvertering en macrofaag isolatie en latere celoppervlak antilichaam kleuring voor flow cytometrische analyse. Dit protocol adressen bestaande complexiteit onderliggende TL-activated cell sorting (FACS) en presenteert deze complexe situatie teneinde de karakterisering van de breed scala van voldoende gesorteerde cel populaties verduidelijkingen. Verrijking van de alternatieve methoden zijn opgenomen voor het sorteren van de cellen, zoals de dichte lever, waardoor flexibiliteit en time management bij het werken met FACS. Kortom, dit protocol helpt de onderzoeker te evalueren macrofaag heterogeniteit uit een veelheid van ontstoken weefsels in een bepaalde studie en biedt inzichtelijke tips voor probleemoplossing die zijn geslaagd voor gunstige cellulaire isolatie en karakterisatie van immuuncellen in DIO-gemedieerde ontsteking.
Introduction
Muismodellen zijn uitvoerig gebruikt om de dynamiek van ziekten bij de mens te bestuderen. Goede isolatie van resident weefselcellen van muizen in een zieke toestand kan een platform bieden voor het begrip van de moleculaire en cellulaire bijdragen aan de pathogenese van een ziekte1. Een stoornis die is van cruciaal belang is obesitas. De incidentie van obesitas blijft stijgen wereldwijd parallel met insulineresistentie en type 2 diabetes mellitus, hart-en vaatziekten en vette lever ziekte2,3. Overmatige consumptie van nutriënten is verder vertekend door verminderde fysieke activiteit triggering veranderde signalen afkomstig van vetweefsel, die de cellulaire omgeving van andere perifere weefsels zoals de aorta en de lever4 veranderen kan. Dergelijke verstoring van metabole homeostase resulteert in een chronische lage rang systemische ontsteking5.
Klassieke activering van macrofagen ingezetene aan de aorta en lever evenals hun aanwerving aan witte adipeus weefsel (WAT) heeft aangetoond dat niet alleen initiëren disregulatie van metabole signalen maar ook ondersteunen ontsteking6,7. De fenotypische en functionele heterogeniteit van macrofagen is sterk geassocieerd met de pathogenese van obesitas gerelateerde co-morbiditeit7. De dynamische plasticiteit in macrofaag polarisatie voorziet in deze cellen te exposeren een aantal geactiveerde fenotypen die de progressie coördineren en resolutie van ontsteking8. Terwijl klassiek geactiveerd (M1) macrofagen zijn betrokken bij de verspreiding van de ontsteking, zijn als alternatief geactiveerd (M2) macrofagen geassocieerd met resolutie en weefsel reparatie9,10.
Als het lichaam metabole stress ondergaat, witte vetweefsel abnormaal worden bij elkaar opgeteld. De uitgebreide adipeus weefsel aantrekt en behoudt ontstekingscellen die normale adipocyte functie ter bevordering van insulineresistentie, hyperglycemie en uiteindelijk diabetes mellitus type 2, insulineresistentie of hyperglykemie11, ingrijpend te veranderen 12. Parallel, witte vetweefsel vernieuwt in reactie op inflammatoire signalen vrijgegeven door geïnfiltreerd klassiek geactiveerd (M1) adipeus weefsel macrofagen (geldautomaten)13,14. Deze multi-cellulaire orgel oefent een cascade van signalen die de normale functie van andere lichaamsorganen zoals de aorta en de lever4ontspoort.
De lever is een metabole powerhouse dat zich aanpast in reactie op prikkels afkomstig van de nabijgelegen dysregulated WAT15. Hepatische macrofagen of Kupffer cellen, in reactie op metabolische veranderingen, afscheiden van inflammatoire cytokines die transformeren van beide parenchymal en niet-parenchymal cel fenotype en bevordering van de weefsel remodeling. Hepatische lipide accumulatie, ontsteking, overmatige extracellulaire matrix deposito’s, necrose en uiteindelijke functie verlies volgt de inflammatoire beledigingen bij te dragen tot het brede spectrum van leverschade gekoppeld aan non-alcoholische vette leverziekte 16,17,18.
Parallel aan gecompromitteerde WAT en leverfunctie accumuleren grote arteriën lipiden binnen de arteriële muur als het lichaam chronische metabole stress19 ondergaat. Arteriële lipide accumulatie activeert de secretie van chemokines door geactiveerde endotheliale cellen en latere indienstneming van monocyten20. Zodra aangeworven, monocyten vermenigvuldigen, onderscheiden, inslikken lipoproteïnen en schuim cellen. Atherogenese is gestart en wordt ondersteund door de pro-inflammatoire activiteit van aangeworven en weefsel resident lipide-beladen macrofagen. Bezwijken aan de extracellulaire en intracellulaire stress signalen doorgegeven in dit atherogene communicatie, deelnemen deze macrofagen vervolgens aan een apoptotic cascade signalering. Als deze schuim cellen sterven, dragen zij hun lipide gevuld inhoud aan de necrotische kern van de laesie, wat vervolgens tot plaque breuk, hartinfarct en beroerte leidt.
De heterogeniteit van de macrofaag fenotypen regisseert collectief, gedeeltelijk de obesitas geïnduceerd door ontstekingsreactie waargenomen in dysregulated weefsels zoals WAT, lever en aorta8,21. Karakterisering van aangeworven en weefsel resident macrofagen kunnen inzicht geven in mogelijke moleculaire doelwitten die macrofaag fenotype1 manipuleren. Effectief karakteriseren macrofagen van obesitas-geïnduceerde ontstoken weefsels, kan een eencellige schorsing verkregen worden door enzymatische spijsvertering. Dergelijke dissociatie protocollen moet effectief in voldoende vernederende bindweefsel terwijl het minimaliseren van immuun celdood en bieden optimale cel opbrengst. Het enzym mengsel is afhankelijk van het soort weefsel en de structurele make-up. Veerkrachtig weefsel zoals de aorta vereist sterkere enzymatische activiteit, in vergelijking met de lever en WAT, om weefsel dissociatie. Uit de eencellige suspensie, kunnen het weefsel resident macrofagen ondubbelzinnig worden gekenmerkt of geïsoleerd voor verder stroomafwaarts analyses uitgevoerd, zoals transcriptionele profilering.
Hier wordt een weefsel-specifieke protocol beschreven dat collagenase-afhankelijke weefsel spijsvertering en polychromatische stroom cytometry gebruikt om effectief te isoleren en karakteriseren van weefsel-ingezeten macrofagen verkregen uit traditionele dieet geïnduceerde obesitas, atherosclerose, eenvoudige steatosis en steatohepatitis Muismodellen. Gelijktijdige kleuring van oppervlakte markeringen in een cel met antilichamen tegen leukocyten-(CD45 en/of CD11b) en macrofaag – specifieke antigenen (F4/80) wordt vaak gebruikt om te identificeren macrofaag populaties22. Fluorescentie-activated cell sorting (FACS) is een krachtige strategie gebruikt voor het sorteren van deze geïdentificeerde risicopopulaties hoge zuiverheid. De gesorteerde bevolking kan vervolgens worden geëvalueerd voor fenotype specifiek gen profielen met behulp van downstream moleculaire analyse (zoals kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie)23. Hoewel de standaard stroom cytometry en stroom cytometry gebaseerde cel Sorteren krachtige hulpmiddelen macrofagen binnen een sterk heterogene celsuspensie onderscheid aan te brengen zijn, moeten de voormalige protocollen worden geoptimaliseerd zodat succesvolle uitvoer. In deze studie worden protocollen dat effectief isoleren en karakteriseren van levensvatbare weefsel specifieke macrofagen beschreven; wat nog belangrijker is, biedt deze studie cruciaal inzicht in technische kwesties die vaak ontstaan, evenals strategieën van de proactieve en oplossen van problemen te voorkomen en/of lossen ze.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieet-geïnduceerde stofwisselingsziekte modellen die co morbiditeit zoals atherosclerose, eenvoudige steatosis, steatohepatitis nabootsen en diabetes type 2 worden uitgebreid gebruikt voor een beter begrip van de moleculaire mechanismen van progressie van de ziekte. Collagenase afhankelijke spijsvertering wordt vaak gebruikt om weefsels te bevrijden van de cellen van de extracellulaire matrix (ECM)16,27te distantiëren. Enzymen zoals collagenase verstoren collag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedank de Stroom Cytometry Core faciliteit in de Pennsylvania State Universiteit Millennium wetenschap Complex.
Materials
| 26G x 5/8 in Needles | BD | 305115 | |
| 23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set | BD | 367297 | Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion |
| 21G 1 1/2 in. Needles | BD | 305156 | |
| 1mL syringe with rubber stops | BD | 309659 | |
| 10mL Syringes | BD | 309604 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| F4/80 PE | Biolegend | 123110 | |
| CD11c PE/Cy7 | Biolegend | 117318 | |
| CD11b PE/Cy5 | eBioscience | 15-0112-81 | |
| Anti-mouse CD16/32 Fc Block | Biolegend | 101320 | |
| CD45 Pacific Blue | Biolegend | 103126 | |
| PE Rat IgG2a | Biolegend | 400508 | |
| PE/Cy7 Armenian Hamster IgG | Biolegend | 400922 | |
| PE/Cy5 Rat IgG2b | Biolegend | 400610 | |
| Pacific Blue Rat IgG2c | Biolegend | 400717 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 15-017-CV | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |
| 70 micron cell strainers | Corning, Inc. | 352350 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X | Electron Microscopy Sciences | CAS #30525-89-4 | |
| Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp | Stoelting | 52132-10P | Used for general dissecting purposes |
| Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm | Stoelting | 52102-37P | Used for general dissecting purposes |
| Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge | Fine Science Tool | 15000-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps | Fine Science Tool | 11297-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Hemostatic Forceps (Curved) | Fine Science Tool | 13021-12 | |
| Heparin Sodium Salt | Fischer Scientific | 9041-08-1 | |
| 35mm Cell Culture/Petri Dishes | Fischer Scientific | 12-565-90 | |
| Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid | Fischer Scientific | 08-757-100D | |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-959-53A | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| 5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fischer Scientific | 14-959-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) | Millipore | EX0285-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Rockland | BSA-50 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Collagenasse Type XI | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Hyaluronidase Type I | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| 500mL beaker | Sigma Aldrich | 02-540M | |
| 4 cm Hemostatic clamp | Stoelting | 52120-40 | |
| Toothed forceps | Stoelting | 52104-33P | |
| 50 micron Disposable filters | Systemex | 04-0042-2317 | |
| Collagenase Type IV | ThermoFischer Scientific | 17104019 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) | ThermoFischer Scientific | A1049201 | |
| Razors (0.22 mm (0.009")) | VWR International | 55411-050 | |
| Texas Red Live/Dead stain | Red viability stain (in Figure 1A) |
References
- Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (12), 840-846 (2006).
- Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (12), 875-880 (2006).
- Jung, U., Choi, M. -. S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).
- Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
- Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).
- Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).
- Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).
- Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).
- Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).
- Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).
- Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
- Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).
- Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).
- Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).
- Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).
- Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174 (2014).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848 (2011).
- Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, 247-252 (2014).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).
- Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).
- Yu, Y. R. A., O’Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).
- Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).
- Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).
- Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
- Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).
- Kim, Y. -. J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).
- Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6 (3), 13 (2014).
- Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).
- Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).
